内标法研究甘遂及其炮制品的指纹图谱
【摘要】 目的 建立甘遂饮片及其炮制品的指纹图谱。方法 采用高效液色谱法：以胡薄荷酮作为内标参照物，乙腈?水为流动相（梯度洗脱），流速 1.0 mL·min-1，检测波长235 nm，柱温30 ℃。结果 甘遂饮片及其醋制品共有17个共有峰；炮制品与生品比较，有2种成分含量增加约40%左右，1种成分含量减少达70%；17个共有峰的相似度均在0.95以上。结论 该测定方法简便，准确，重现性好，所制定的甘遂指纹图谱具有可靠性，可控制甘遂及其炮制品的内在质量。
【关键词】 甘遂 高效液相色谱法 指纹图谱 内标法
Abstract:Objective To establish the fingerprints of Kansui and their processed products.Methods Pulegone was used as the internal standard. The mobile phase consisted of acetonitrile?water (gradient elution). The detection wavelength was set at 235 nm and column temperature 30 ℃．Key words: HPLC；fingerprints；internal standard method
甘遂为大戟科大戟属植物甘遂（Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.P.Wang）的干燥块根［1］，主产于陕西、山西等地，本品苦寒有毒，具有泻水逐饮、破积通便之功，常用于水肿、腹水、大小便不利等症［2］。甘遂炮制后能降低毒性，缓和峻泻作用，因此研究出甘遂炮制前后其化学成分的变化情况，为其炮制机理研究和临床合理应用提供依据，同时寻找一种全面质量控制标准显得尤为重要。本试验以胡薄荷酮（pulegone）作为内标参照物，采用高效液相色谱法，对不同产地甘遂的生品及醋制品进行了指纹图谱研究。
1 仪器与试药
Waters 515高效液相色谱仪，Waters 2487 双波长紫外检测器，Millennium32数据处理系统；Kromasil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)色谱分析柱（大连化学物理研究所）。
胡薄荷酮对照品（纯度＞98%），批号：1052990，购自Aldrich Ehemical Company,Inc；乙腈（色谱醇，美国Tedia公司）；自制重蒸去离子水。
生甘遂饮片十批(陕西产编号0l, 02, 03，04批；山西产编号05, 06批；河南产编号07, 08批；市场统货09，10批)，醋甘遂饮片（陕西产编号Ol, 02, 03，04批；山西产编号05, 06批；河南产编号07, 08批；市场统货09，10批)，炮制品09、10批直接购自市场，其余均按炮制规范化的标准工艺炮制。药材经本院中药鉴定教研室吴启南教授鉴定为大戟科大戟属植物甘遂（Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.P.Wang）的块根。甘遂药材分别购自安徽省亳州市药材总公司、无锡山禾集团靖江医药有限公司、南京中医药大学百草堂、国医堂门诊部。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Kromasil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm) 为色谱柱。以水为流动相A，乙腈为流动相B，进行二元梯度洗脱：0～13 min,5%～25% B；13～20 min,25%～55% B；20～30 min, 55%～60% B；30～45 min, 60%～100% B；45～85 min, 100% B。流速：1.0 mL·min-1，检测波长：235 nm，进样量：10 μL，柱温：30 ℃。
2.2 供试品溶液的制备
分别称取甘遂、醋甘遂粉末(过24目筛)约20 g，加体积分数为95%的乙醇100 mL回流提取，3次，每次2 h，滤液浓缩，真空干燥，所得浸膏用甲醇溶于25 mL容量瓶中至刻度，生品、醋制品分别加入2.5 mL、2 mL浓度为1 mg·mL-1的胡薄荷酮作为内标参照物，所得混合液用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。HPLC分析前用0.45 μｍ微孔滤膜过滤。
2.3 指纹图谱的方法学验证
2.3.1 稳定性试验 取01号甘遂按“2.2”项方法制备溶液，分别于0、2、4、8、16、24 h依法进行检测，获取指纹图谱。结果表明，各共有峰相对保留时间及相对峰面积（RSD）均＜3%。表明24 h内供试品溶液的成分稳定。
2.3.2 精密度试验 取01号甘遂按“2.2”项方法制备溶液，依法连续进样5次，对主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积进行比较，RSD均＜3%。
2.3.3 重现性试验 取批号为01的样品，按“2.2”项方法制备溶液5份，同法检测，以胡薄荷酮为对照，各共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD均＜3%。
2.4 结果
2.4.1 甘遂指纹图谱 按供试品溶液制备方法，制备4个产地生品、醋制甘遂各10批的样品溶液。按“2.1”项下条件测定，记录色谱图并进行分析，结果17个峰是所有样品共有的峰，确定其为指纹峰，生品、醋制甘遂各10批样品的指纹图谱见图1、图2，HPLC参照指纹图见图3。
2.4.2 相似度评价 采用国家药典委员会《中药指纹图谱相似度评价系统2004A版》对上述年终批次药材的指纹图谱进行了相似度的分析，以相关系数（中位数）代表其相似度，得10批生品的相似度分别为：0.982、0.986、0.996、0.995、0.997、0.981、0.989、0.990、0.991、0.981。10批醋制品的相似度分别为：0.991、0.975、0.984、0.990、0.991、0.989、0.991、0.987、0.994、0.986。结果生品及醋制品的相似度均在97%以上。
3 讨论
3.1 通过DAD检测器对样品进行波长200～400 nm处扫描，并查阅，经综合考虑，235 nm处色谱峰较多，峰吸光度较大且峰形较好，故选择235 nm作为测定波长。本文曾比较了汉邦Lichrospher C18 (4.6 mm×20 cm)，Waters Nova?Park C18 (3.9 mm×15 cm)等几种色谱柱，结果显示汉邦Kromasil C18(4.6 mm×20 cm)色谱柱分离效果较好。作者曾考察了3种流动相系统：甲醇?水，乙腈?水，乙腈?水（0.05%TFA）进行梯度洗脱，结果表明，甲醇?水系统中基线漂移严重，乙腈?水（0.05%TFA）与乙腈?水系统差别不大，从保护色谱柱与仪器角度出发，选择较简便、出峰最多的乙腈?水系统。2 h图谱显示，85 min后没有其他特征峰出现。
图1 10批甘遂生品饮片指纹图谱（略）
Fig.1 Fingerprints of 10 batches of Euphoria Kansui
图2 10批醋制甘遂饮片指纹图谱（略）
Fig.2 Fingerprints of 10 batched Euphoria Kansui processed by vinegar
图3 甘遂药材参照指纹图谱（略）
Fig.3 Fingerprints of Euphoria Kansui for control
3.2 选择内标物时，比较了pulegone、AlisolA、B，Oleanolic等几种萜类物质，结果发现pulegone既和甘遂各成分能达到较好分离，且与甘遂两者供试液混合后均无化学成分变化。
3.3 实验结果表明，10个批次的甘遂饮片指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，但各成分含量的相对比值有所不同，炮制前后指纹图谱有所变化，各成分含量升降不一，其中炮制后2种成分含量增加约40%左右，1种成分含量减少达70%，但成分的定性尚待进一步研究。
3.4 本文采用HPLC色谱法，初步建立了甘遂及醋甘遂的醇提液指纹图谱分析方法，结果表明，本文方法稳定，可靠，重现性好。
【文献】
［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：化学出版社，2005:60.
［2］ 肖培根.新编中药志［M］.北京:化学工业出版社，2001:280.
