垂盆草中总黄酮含量的测定

【摘要】  目的 建立垂盆草中总黄酮含量的测定方法。方法 采用紫外分光光度法，测定波长为501 nm。结果 总黄酮检测浓度在0.010 36～0.082 88 mg/mL范围内与吸光度线性关系良好(r=0.9998)，平均加样回收率为98.62%(RSD=1.11%，n=6)。结论 本方法用于垂盆草中总黄酮的含量测定，结果准确、可靠、稳定。

【关键词】  紫外分光光度法；垂盆草；总黄酮；含量测定

　　垂盆草(Sedum sarmentosum Bunge)又称卧茎景天，系景天科多年生草本植物垂盆草的新鲜或干燥的全草，我国大部分地区均有分布。该药味甘、淡、性凉，具有清热解毒、利尿消肿、排脓生肌之效，主治丹毒溃疡，小便不利及急、慢性肝炎等。据有关报道，垂盆草中含有氰苷、黄酮类、甾醇类和三萜类等化合物［1，2］。潘金火等［3，4］对垂盆草的保肝降酶活性成分进行了一系列的研究，证明垂盆草中具有保肝降酶作用的活性成分主要存在于H2O部分和n?BuOH部分（主要含苷类和总黄酮），进而确认其中的总黄酮是垂盆草中保肝降酶的主要活性组分之一。本文采用经典的比色法对垂盆草中的总黄酮含量进行测定，以为其后继的开发利用提供依据。

　　1  仪器与试药
    
　　UV?2401型可见紫外分光光度计(日本岛津公司)；bp211D型十万分之一天平(德国赛多利斯公司)；索式提取器等。
    
　　芦丁对照品(药品生物制品检定所,批号:086-9303)；垂盆草(购于安徽省毫州市药材总公司，经南京中医药大学中药鉴定教研室王春根教授鉴定为Sedum sarmentosum Bunge的干燥全草，粉碎至40～60目)；亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、乙醇等为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  对照品溶液的制备
    
　　精密称取于120 ℃下减压干燥至恒重的芦丁对照品10.36 mg，置50  mL容量瓶中，加80%（体积分数）乙醇35 mL超声使之完全溶解，冷却至室温，以80%（体积分数）乙醇稀释至刻度，摇匀，得浓度0.2072 mg/mL的芦丁对照品溶液，冷藏，备用。

　　2.2  供试品溶液的制备
    
　　精密称取垂盆草药材粉末1.0 g，置索氏提取器中，加石油醚（60～90 ℃）100  mL在85 ℃水浴温度条件下回流提取至无色，弃去石油醚，药渣挥干石油醚，再用80%（体积分数）乙醇100 mL在100 ℃水浴温度条件下回流提取6 h，冷却后，用80%（体积分数）乙醇定容至100 mL,备用。

　　2.3  定性鉴别反应

　　2.3.1  氨水反应
    
　　取样品溶液点于滤纸上，将滤纸在氨水上方熏15 min，立即置紫外光下观察(254 nm)，呈黄绿色荧光斑点。

　　2.3.2  三氯化铝反应
    
　　取样品溶液点于滤纸上，滴加5%（质量分数）三氯化铝甲醇溶液，吹干呈灰黄色，在紫外光下(254 nm)观察，呈黄绿色荧光斑点。

　　2.3.3  盐酸-镁粉反应
    
　　取样品1 mL，加少许镁粉，再滴加几滴浓盐酸，水浴加热2 min后显红色。

　　2.4  测定波长的选择
    
　　精密量取对照品溶液3 mL和供试品溶液5 mL，分别置10 mL容量瓶中，加5%（质量分数）亚硝酸钠溶液0.4 mL，混匀，放置6 min；加10%（质量分数）硝酸铝溶液0.4 mL，放置6过min；加4%（质量分数）氢氧化钠溶液1.0 mL，用80％（体积分数）乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min，以80％（体积分数）乙醇为空白同法配制空白对照液。在400 ～700 nm波长处扫描，对照品与供试品溶液显色后均在501 nm左右波长处有最大吸收，故将501 nm作为测定波长。紫外光谱图见图1。

　　1．供试品;2．芦丁对照品;3．阴性对照

　　图1  紫外扫描图谱（略）

　　Fig.1   UV Spectrum

　　2.5  专属性试验
    
　　取“2.2”项下供试品溶液5 mL,置10 mL容量瓶中，加80%（体积分数）乙醇至刻度，以80%（体积分数）乙醇溶液为空白对照液，在400～700 nm波长处扫描。未经显色的供试品在501 nm左右波长处基本无吸收，说明此显色方法的专属性较强。紫外扫描光谱见图1。

　　2.6  标准曲线的绘制
    
　　分别精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，各置10 mL容量瓶中，分别加80%（体积分数）乙醇至5 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，混匀，静置6 min；加入10%（质量分数）硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀，静置6 min，加入4%（质量分数）氢氧化钠溶液1.0 mL，再加80%（体积分数）乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以80％（体积分数）乙醇为空白同法配制空白对照液。分别于501 nm波长处测定吸光度，以吸光度值(A)对质量浓度(ρ)进行线性回归，得回归方程ρ=0.086 5A+0.001 2(r=0.999 8)。结果表明，芦丁检测浓度在0.010 36～0.082 88 mg/mL范围内线形关系良好。

　　2.7  精密度试验
    
　　取“2.1”项下对照品溶液5 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.4”项下的方法显色，于501 nm波长处测吸光度5次。结果，吸光度平均值为0.4616，RSD=1.94%，表明该方法精密度良好。

　　2.8  稳定性试验
    
　　取“2.2”项下供试品溶液5 mL,置10 mL容量瓶中，按“2.4”项下的方法显色，于0、20、40、60、80、100、120 min时测定吸光度。结果RSD=1.16％。表明样品显色后120 min内稳定性良好。

　　2.9  重现性试验
    
　　取药材样品1.0 g，共6份，精密称定，按“2.2”项下方法制备各供试品溶液，各取5 mL再按“2.4”项下的方法显色，于501 nm波长处测定吸光度。按标准曲线法，结果，总黄酮的平均含量为1.21%，RSD=1.67%，表明本方法重现性良好。

　　2.10  加样回收率试验
    
　　精密称取于120 ℃下减压干燥至恒重的芦丁对照品50.86 mg，置50 mL容量瓶中，加80%（体积分数）乙醇35 mL超声使之完全溶解，冷却至室温，以80%（体积分数）乙醇稀释至刻度，摇匀，得浓度1.0172 mg/mL的芦丁对照品溶液，备用。取垂盆草药材约0.5 g，共6份，精密称定，置索氏提取器中，分别加入浓度为1.0172 mg/mL的芦丁对照品溶液6 mL，按“2.2”项下方法制备各供试品溶液。取各供试品溶液5 mL，再按“2.4”项下的方法显色，于501 nm波长处测定吸光度，采用随行标准，标准曲线法定量，结果见表1。

　　2.11  样品含量测定
    
　　取3个批号的垂盆草药材约1.0 g,每批两份，精密称定，按“2.2”项下的方法制备各供试品溶液，各取5 mL再按“2.4”项下的方法显色，于501 nm波长处测定吸光度。按标准曲线法计算，结果3个批号070101、070111、070121的总黄酮含量分别为1.21%、1.24%和1.20%。

　　表1  芦丁加样回收率试验（略）

　　Tab.1  Results of recovery test

　　3  讨论
    
　　提取总黄酮可采用不同浓度的甲醇、乙醇、丙酮等作溶剂，但黄酮类化合物基本不溶于石油醚［5，6］，故先用石油醚脱脂，再选用80%（体积分数）乙醇作溶剂，可将黄酮苷和苷元较完全地提取出来，并避免和减少多种水溶性成分的溶出。实验结果表明，在该条件下总黄酮含量较高，为1.22％。垂盆草中黄酮类化合物具有很好的保肝降酶作用，所以垂盆草有很好的开发利用价值。

【】
  　　［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京:化学出版社，2005.148．

　　［2］ 魏太明，阎玉凝，关昕璐，等．垂盆草的化学成分研究Ｉ［J］．北京中医药大学学报，2003，26（4）：59-60．

　　［3］ 潘金火，何满堂，许惠琴，等．垂盆草中保肝降酶活性组分的筛选［J］．药事，2002，16(6):365-366.

　　［4］ 潘金火，何满堂，罗兰，等．垂盆草不同提取部位保肝降酶试验［J］．时珍国医国药，2001，12(10):888-890.

　　［5］ 陈晓青，蒋新宇，刘佳佳．中草药成分分离分析技术与方法［M］．北京:化学工业出版社，2006：59．

　　［6］ 潘金火.垂盆草的化学、药理及其注射液制备工艺和质量标准研究［D］.南京:南京中医药大学,2000.