一种高效分离大黄酚和大黄素甲醚的简便方法
作者：王定勇，陈铭祥，冯玉静
【摘要】 目的 研究大黄酚和大黄素甲醚混合物的高效分离方法。方法 采用硅胶柱色谱进行分离，薄层色谱跟踪检测，HPLC检测产品纯度。结果 在以级柱层析硅胶（100～200目）为填充剂的色谱柱上，以石油醚?乙酸乙酯?甲酸(体积比100∶1∶0.5)为洗脱剂，可以将大黄酚和大黄素甲醚完全分离。结论 硅胶柱色谱可以实现大黄酚和大黄素甲醚的高效分离；产品经HPLC检测，纯度达99%以上。
【关键词】 柱色谱法；大黄酚；大黄素甲醚
Abstract:Objective To study the efficient and simple method of separation of chrysophanol and physcion.Methods Using silica gel column chromatography for separation,TLC for tracking and detection,HPLC for purity detection of the products.Results Chrysophanol and physcion could be completely separated by industrial silica gel column chromatography ［100～200 mesh, petroleum ether?ethyl acetate?formic acid (100∶1∶0.5) as elute］. Conclusion Chrysophanol and physcion could be effectively separated by silica gel column chromatography.Their purities were ≥99% by HPLC method.
Key words:column chromatography；chrysophanol；physcion
大黄(Rheum officinale Baill.) 为常用中药,具有泻下、抗菌、抗肿瘤、抗高脂血症、降低血压、健胃、利胆、保肝、强心、消炎、延缓衰老、调节免疫等作用［1］。大黄的主要有效成分是其中的5种游离蒽醌类化合物（见图1），例如，大黄酸具有抗肿瘤、抗炎、抗菌及调节肾功能等作用［2］；大黄素具有抑菌、抗炎、保护肝肾、抑制血小板聚集、改善微循环、抗癌等作用［3］；芦荟大黄素具有清除氧自由基、诱导肿瘤细胞凋亡等作用［4］；大黄素甲醚可通过血脑屏障，具有很强的抗炎作用［5］；大黄酚具有抗衰老作用、止血作用［6］。大黄酸、大黄素和芦荟大黄素可以通过简单的pH 梯度萃取法和重结晶得到单体，而大黄酚和大黄素甲醚在植物体内常共同存在，它们结构相似，酸性与极性相近，分离很困难。大黄酚和大黄素甲醚不仅具有较好的药理活性，而且大黄酚通过氧化反应可以转化为大黄酸，通过卤代和水解反应可以转化为芦荟大黄素；大黄素甲醚通过脱甲基化反应可以转化为大黄素。因此，大黄酚和大黄素甲醚单体的简单获取具有重要意义。我们在大黄的综合深加工研究中，得到了大量大黄酚和大黄素甲醚的混合物，并通过多次实验探索，找出了一种快捷、简单、高效的分离方法，现报道如下。
图1 大黄中5种主要游离蒽醌类化合物的结构式（略）
Fig.1 The structures of five main active anthraquinones of Rheum officinale
1 仪器与试剂
1.1 仪器
RE?52cs旋转蒸发器（巩义市英峪予华仪器厂）；恒温水浴锅（深圳市国华仪器厂）；SHB?Ⅲ 循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。
1.2 试剂
大黄酚和大黄素甲醚混合物（自制，从大黄中分离得到）；柱层析硅胶（工业级，100～200目，青岛海洋化工厂）；薄层层析硅胶G（化学纯，青岛海洋化工厂）；石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷等均为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）；大黄酚和大黄素甲醚对照品（药品生物制品检定所）。
2 方法与结果
2.1 薄层硅胶板的制备
配制质量分数为0.3％的羧甲基纤维素钠(CMC?Na)水溶液，与薄层层析硅胶G粉，按3 mL∶1 g的比例配制调浆，以载玻片作为载体铺板，铺好后晾干，于105 ℃下活化1 h，放入干燥器中，备用。
2.2 色谱柱的制备
取一根内径和长度合适的玻璃层析柱，用洗脱剂湿法装柱，用手轻敲柱子，使硅胶装填结实且顶端平整，有效柱长控制在20 cm左右，硅胶用量为样品量的200倍。
2.3 样品的制备
大黄酚和大黄素甲醚的混合物用最少量的三氯甲烷溶解，再加入适量硅胶拌样（硅胶∶样品=20∶1，质量比），待氯仿挥发干后均匀铺于柱顶。
2.4 洗脱
以石油醚（60～90 ℃）?乙酸乙酯?甲酸(体积比100∶1∶0.5)为洗脱剂，进行洗脱，洗脱液减压浓缩后可循环利用。
2.5 色谱带的定位
洗脱一定时间后可以看见两段明显的色谱带，洗脱得快的那一段为大黄酚，较慢的那一段为大黄素甲醚。继续洗脱，分别得到橙红色颗粒状结晶（大黄酚）和橙黄色针状结晶（大黄素甲醚）。
2.6 薄层色谱鉴定
取制备好的薄层硅胶板，以石油醚?乙酸乙酯?甲酸（体积比10∶1∶0.5）为展开剂，以对照品作对照，确定橙红色颗粒状结晶为大黄酚，橙黄色针状结晶为大黄素甲醚。
2.7 大黄酚和大黄素甲醚纯度的HPLC检测方法(归一化法)
色谱柱为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为30 ℃ ，进样量为10 μL，流动相为甲醇?质量分数为0.1％的磷酸溶液(体积比85∶15)，流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm。检测结果表明大黄酚纯度为99.01%，大黄素甲醚纯度为99.06%。色谱图见图2、3。
图2 大黄酚的HPLC图（略）
Fig.2 HPLC of chrysophanol
图3 大黄素甲醚的HPLC图（略）
Fig.3 HPLC of physcion
3 讨论
3.1 大黄酚和大黄素甲醚的分离研究，国内已有多篇报道：将样品先用经预处理的一定粒度的磷酸氢钙柱层析，然后用苯［7］或石油醚［8］洗脱，但此操作繁琐、费时，且苯的毒性较大；用纤维素柱层析易于分离、洗脱剂较单一(水饱和石油醚)，但纤维素粉制备费时［9］；也有人用薄层硅胶常压湿柱层析，然后用石油醚?丙酮或石油醚?乙酸乙酯(体积比15∶1)［10］洗脱，虽然洗脱速度很快，但两者的分离度不是很理想。本文用级柱层析硅胶（100～200目）作柱层析进行分离，可在较短时间内获得完全分离，方法有效，简便，且洗脱剂可以循环使用，节省试剂。
3.2 装柱技术和加样技术可直接影响分离效果，宜采用较低活性的吸附剂，如硅胶的活性在Ⅱ～Ⅲ级较好，对于高活性的吸附剂预先用10％的展开剂进行饱和，否则在展层过程中，溶剂前沿不易整齐，影响层带分离；加样时，一定要均匀地平铺于柱顶，否则会出现层带交叉现象。
3.3 铁离子能与大黄素甲醚生成络合物，于50 ℃热结构易破坏。因此，在用硅胶柱层析法分离大黄素甲醚和大黄酚的过程中，应避免与铁离子的接触，特别需要控制硅胶中的铁含量，含铁量低于0.02％的层析硅胶影响较小。
3.4 大黄酚和大黄素甲醚混合物的上样量一般为0.2 g，量再增加就不能使它们完全分离［11］，而本文的上样量达到5 g,且能得到完全分离。
3.5 大黄酚和大黄素甲醚属于蒽醌类化合物，酚羟基呈弱酸性，本实验在柱层析洗脱剂和薄层展开剂中加入少量酸，目的是为了防止大黄酚和大黄素甲醚产生拖尾，从而使分离效果更佳。
【文献】
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