脑得生丸中葛根异黄酮的提取工艺研究
作者:李坷平,王俊永,梁生旺
【摘要】 目的 优选脑得生丸中有效成分葛根异黄酮的提取工艺。方法 以正交设计安排试验,采用高效液相色谱法测定葛根素和大豆苷的含量,并以此为指标考察溶剂浓度、溶剂用量、提取时间3个因素对异黄酮提取率的影响。结果 用12倍量的体积分数为40%的乙醇回流提取2次,每次1 h的条件为最佳提取工艺。结论 本提取工艺设计合理,稳定,可为脑得生丸的进一步开发提供可靠的实验依据。
【关键词】 脑得生丸;异黄酮;葛根;大豆苷;提取工艺
脑得生丸收载于《药典》2005年版一部,由三七、川芎、红花、山楂和葛根等加工而成的蜜丸[1]。具有活血化瘀、疏通经络、醒脑开窍之功效,是脑动脉硬化、脑中风及脑出血后遗症的常用药。葛根为豆科植物野葛[Pueraria lobata (Willd.) Ohwi]的干燥根,主要含有葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类成分,能改善冠脉、脑和外周血循环,抑制血小板聚集,降低血压,降低心肌耗氧量[2,3]。由于脑得生丸处方所含有效成分的极性差别较大,为进一步纯化的需要,本课题组将其处方分为葛根、红花和三七、川芎、山楂两个部分,分别进行提取工艺研究。本文对葛根和红花这部分进行报道,以葛根素、大豆苷作为异黄酮类成分的定量指标,探讨了脑得生丸中葛根异黄酮的最佳提取工艺条件。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters 2695型高效液相色谱仪;Waters 2996二级管阵列检测器;Waters Empower色谱工作站;RE52CS旋转蒸发仪和B?220型恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂);十万分之一分析天平(SHIMADZU);纯水制备系统(重庆艾科浦);SHB?IV22B循环水多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。
1.2 试药
色谱甲醇,自制纯净水,其它试剂均为分析纯;葛根和红花药材购于河南省药材总公司,由我院生药教研室李书渊教授分别鉴定为豆科植物野葛[Pueraria lobata (Willd.) Ohwi]的干燥根和菊科植物红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花;葛根素和大豆苷对照品(批号:7522200108,中国药品生物制品检定所)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
以十八烷基键合硅胶柱为色谱柱;以甲醇?水(体积比20∶80)为流动相;检测波长为250 nm;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃。
2.2 对照品溶液的配制
精密称取葛根素和大豆苷对照品,分别置10 mL容量瓶中,加入甲醇5 mL,超声溶解后,用甲醇定容至刻度,制得葛根素质量浓度为0.512 mg·mL-1,大豆苷质量浓度为0.925 mg·mL-1,密封保存,备用。
2.3 药材溶液的制备
取葛根药材粉末(过3号筛),精密称定,置锥形瓶中,精密加体积分数为50%的甲醇50 mL,称定重量,加热回流30 min,放冷,再称定重量,用体积分数为50%的甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.4 标准曲线的制备
分别精密移取对照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0 mL 置10 mL 容量瓶中,用甲醇定容至刻度。0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液。进样体积10 μL,按色谱条件测得进样量与峰面积,回归方程,结果见表1。
表1 两种异黄酮的回归方程和线性范围(略)
Tab.1 Regression equations and linear ranges of two kinds of Isoflavone
2.5 提取工艺条件优选[5]
按复方脑得生丸处方量的1/5,称取红花18.2 g与葛根52.2 g,等量9份药材。按正交设计安排试验 (见表2),回流提取2次,合并滤液,回收溶剂至500 mL,定量移取25 mL,置1 000 mL容量瓶中,加体积分数为50%的乙醇至刻度,滤过,取续滤液作为正交试验的供试样品溶液。进样10 μL,照“2.1”项下色谱条件测定。由外标法分别葛根素和大豆苷含量,两者之和为异黄酮的含量。结果见表3。
表2 因素和水平表(略)
Tab.2 Factors and levels
2.6 阴性干扰试验
称取红花药材18.2 g,加体积分数为40%的乙醇12倍量,回流提取2次,1 h/次。以下操作同“2.5”项操作。色谱图见图1。
A.对照品;B.供试样品;C.阴性样品
1.葛根素;2.大豆苷
图1 高效液相色谱图(略)
Fig.1 HPLC chromatograms
表3 正交实验L9(3)4结果分析表(略)
Tab.3 Analysis of the orthogonal experiment L9(34)
*相当于每克葛根药材中的含量
表4 方差分析表(略)
Tab.4 Analysis of variance
3 讨论
3.1 由表3中的R值可看出,影响异黄酮含量提取的主次因素依次为溶剂浓度>提取时间>溶剂用量。表4的方差分析表明,溶剂浓度对试验有显著性意义,提取时间次之,溶剂用量影响相对较小。但采用低浓度乙醇回流提取时杂质较多,结合生产需要,确定脑得生丸中异黄酮类成分的优选提取工艺为A1B2C2,即:选用12倍量的体积分数为40%的乙醇,回流提取2次,每次1 h。按此工艺进行,以葛根素和大豆苷为指标,相对于葛根药材,其异黄酮的转移率可达到90%以上。
3.2 本研究首次以葛根素和大豆苷为指标,采用高效液相色谱法考察脑得生丸中异黄酮的提取工艺。该方法与[6,7]所采用的UV法相比,结果更准确,所优选的提取工艺切实可行。
【文献】
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