脑得生丸中葛根异黄酮的提取工艺研究
作者：李坷平,王俊永,梁生旺
【摘要】 目的 优选脑得生丸中有效成分葛根异黄酮的提取工艺。方法 以正交设计安排试验，采用高效液相色谱法测定葛根素和大豆苷的含量，并以此为指标考察溶剂浓度、溶剂用量、提取时间3个因素对异黄酮提取率的影响。结果 用12倍量的体积分数为40%的乙醇回流提取2次，每次1 h的条件为最佳提取工艺。结论 本提取工艺设计合理，稳定，可为脑得生丸的进一步开发提供可靠的实验依据。
【关键词】 脑得生丸；异黄酮；葛根；大豆苷；提取工艺
脑得生丸收载于《药典》2005年版一部，由三七、川芎、红花、山楂和葛根等加工而成的蜜丸［１］。具有活血化瘀、疏通经络、醒脑开窍之功效，是脑动脉硬化、脑中风及脑出血后遗症的常用药。葛根为豆科植物野葛［Pueraria lobata (Willd.) Ohwi］的干燥根，主要含有葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类成分，能改善冠脉、脑和外周血循环，抑制血小板聚集，降低血压，降低心肌耗氧量［２，３］。由于脑得生丸处方所含有效成分的极性差别较大，为进一步纯化的需要，本课题组将其处方分为葛根、红花和三七、川芎、山楂两个部分，分别进行提取工艺研究。本文对葛根和红花这部分进行报道，以葛根素、大豆苷作为异黄酮类成分的定量指标，探讨了脑得生丸中葛根异黄酮的最佳提取工艺条件。
1 仪器与试药
1．1 仪器
Waters 2695型高效液相色谱仪；Waters 2996二级管阵列检测器；Waters Empower色谱工作站；RE52CS旋转蒸发仪和B?220型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；十万分之一分析天平（SHIMADZU）；纯水制备系统（重庆艾科浦）；SHB?IV22B循环水多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。
1．2 试药
色谱甲醇，自制纯净水，其它试剂均为分析纯；葛根和红花药材购于河南省药材总公司，由我院生药教研室李书渊教授分别鉴定为豆科植物野葛［Pueraria lobata (Willd.) Ohwi］的干燥根和菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花；葛根素和大豆苷对照品（批号：7522200108，中国药品生物制品检定所）。
2 方法与结果
2．1 色谱条件
以十八烷基键合硅胶柱为色谱柱；以甲醇?水(体积比20∶80)为流动相；检测波长为250 nm；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃。
2．2 对照品溶液的配制
精密称取葛根素和大豆苷对照品，分别置10 mL容量瓶中，加入甲醇5 mL，超声溶解后，用甲醇定容至刻度，制得葛根素质量浓度为0.512 mg·mL-1，大豆苷质量浓度为0.925 mg·mL-1，密封保存，备用。
2．3 药材溶液的制备
取葛根药材粉末(过3号筛)，精密称定，置锥形瓶中，精密加体积分数为50%的甲醇50 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用体积分数为50%的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2．4 标准曲线的制备
分别精密移取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0 mL 置10 mL 容量瓶中,用甲醇定容至刻度。0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液。进样体积10 μL,按色谱条件测得进样量与峰面积,回归方程，结果见表1。
表1 两种异黄酮的回归方程和线性范围（略）
Tab.1 Regression equations and linear ranges of two kinds of Isoflavone
2．5 提取工艺条件优选［5］
按复方脑得生丸处方量的1/5，称取红花18.2 g与葛根52.2 g，等量9份药材。按正交设计安排试验 (见表2)，回流提取2次，合并滤液，回收溶剂至500 mL，定量移取25 mL，置1 000 mL容量瓶中，加体积分数为50%的乙醇至刻度，滤过，取续滤液作为正交试验的供试样品溶液。进样10 μL,照“2.1”项下色谱条件测定。由外标法分别葛根素和大豆苷含量，两者之和为异黄酮的含量。结果见表3。
表2 因素和水平表（略）
Tab.2 Factors and levels
2．6 阴性干扰试验
称取红花药材18.2 g，加体积分数为40%的乙醇12倍量，回流提取2次，1 h/次。以下操作同“2.5”项操作。色谱图见图1。
A.对照品;B.供试样品;C.阴性样品
1.葛根素;2.大豆苷
图1 高效液相色谱图（略）
Fig.1 HPLC chromatograms
表3 正交实验L9(3)4结果分析表（略）
Tab.3 Analysis of the orthogonal experiment L9(34）
*相当于每克葛根药材中的含量
表4 方差分析表（略）
Tab.4 Analysis of variance
3 讨论
3．1 由表3中的R值可看出,影响异黄酮含量提取的主次因素依次为溶剂浓度>提取时间>溶剂用量。表4的方差分析表明，溶剂浓度对试验有显著性意义，提取时间次之，溶剂用量影响相对较小。但采用低浓度乙醇回流提取时杂质较多，结合生产需要，确定脑得生丸中异黄酮类成分的优选提取工艺为A1B2C2,即：选用12倍量的体积分数为40%的乙醇，回流提取2次，每次1 h。按此工艺进行，以葛根素和大豆苷为指标，相对于葛根药材，其异黄酮的转移率可达到90%以上。
3．2 本研究首次以葛根素和大豆苷为指标，采用高效液相色谱法考察脑得生丸中异黄酮的提取工艺。该方法与［6,7］所采用的UV法相比，结果更准确，所优选的提取工艺切实可行。
【文献】
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