干姜超临界CO2提取物的HPLC指纹图谱研究
作者：吴妍，冯毅凡，孟青，芮雯，李卫民
【摘要】 目的 采用高效液相色谱法建立干姜超临界CO2提取物的指纹图谱。方法 采用C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈?0.02 mol/L磷酸为流动相进行梯度洗脱，检测波长为225 nm。结果 10批干姜提取物经中药色谱指纹图谱评价软件，确定10个共有峰作为指纹特征，相似度均达到0.9以上。结论 该法建立的指纹图谱为干姜提取物的质量控制提供基础。
【关键词】 干姜；超临界CO2提取物；HPLC；指纹图谱
Abstract:Objective To establish HPLC fingerprints of Rhizoma zingibers extracts from supercritical carbon dioxide extraction.Methods The extracts were analyzed on a C18 column（4.6 mm×250 mm，5μm）using methanol?0.02 mol/L phosphate acid as gradient eluents.The detection wavelength was 225 nm.Results Ten bathes of the extracts were analyzed by Chinese medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation software,and 10 peaks were identified as fingerprints.The similarity was above 0.9.Conclusion The established fingerprints can be used for the quality control of Rhizoma zingibers extracts from supercritical carbon dioxide extraction.
Keywords: Rhizoma zingibers; supercritical carbon dioxide extraction; HPLC; fingerprints
干姜为姜科植物姜（Zingiber officinale Rosc.）的干燥根茎，用于脘腹冷痛、呕吐泄泻、肢冷脉微、痰饮喘咳等。干姜主要含姜辣素类化合物及少量的挥发油,姜辣素主要成分为6?姜酚及其分解产物姜烯酚、姜酮等［1，2］。［3］采用紫外双波长分光光度法和高效液相色谱法测定干姜中的总酚及6?姜酚的含量。为了进一步完善干姜提取物的质量评价标准，建立一种可以全面评价干姜提取物质量的方法，本研究收集不同产地10批干姜超临界CO2提取物，应用评价软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版》，建立了干姜提取物的HPLC色谱指纹图，并进行相似度评价，为干姜提取物的质量控制提供基础。
1 仪器与试药
1.1 仪器
KQ?250B型超声波清洗器（昆山市超声波仪器厂），分析天平（sartorius公司），Waters2695/2996高效液相色谱仪，评价软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版》（药典委员会推荐）。
1.2 试药
甲醇（Tedia公司）、乙腈（Tedia公司）、磷酸（天津市科密欧化学试剂开发中心），为色谱纯，蒸馏水（屈臣氏）。6?姜酚、8?姜酚、10?姜酚对照品（自制，面积归一化法测定含量98.5%以上），干姜超临界提取物10批（由广州中医药大学李卫民教授鉴定干姜药材并提供干姜提取物）。
1.3 供试品的制备
将10批干姜药材粉碎后，置CO2超临界提取设备中提取，提取条件为：萃取压力20 MPa，温度34 ℃，解析压力7.2 MPa，解析温度35 ℃,得以下10批干姜提取物：0612A?1（广东1），0612A?2（广东2），0612A?3（广东3），0612A?4（河南1），0612A?5（河南2），0612A?6（山东1），061920（山东2），0612A?7（云南1），061122（云南2），061213D（云南3）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
2.1.1 检测波长的选择
应用光电二极管阵列检测器，采集干姜提取物在190～400 nm下的全波长数据，分析10个共有色谱峰在190～400 nm下全波长扫描图（见图1），由图1可知，在225 nm波长下，所有成分均具有较强的紫外吸收，所以确定检测波长为225 nm。
图1 干姜提取物中10个共有峰全波长扫描图（略）
Fig.1 UV chromatograms of 10 co?peaks of extraction from rhizoma zingibers
2.1.2 色谱条件的确定
色谱柱：迪马钻石C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈为流动相A，以0.02 mol/L磷酸为流动相B，按表1的规定进行梯度洗脱；检测波长为225 nm；柱温为30 ℃；流速为1 mL/min。
表1 梯度洗脱程序表（略）
Tab.1 Gradients clution requirement
2.2 溶液的制备
2.2.1 样品溶液的制备
取干姜超临界CO2提取物0.2 置100 mL量瓶，精密称定，加甲醇适量，超声20 min溶解，放冷，甲醇定容至100 mL，摇匀，精密量取1 mL置10 mL量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过,即得。
2.2.2 对照品溶液的制备
取6?姜酚对照品10 mg精密称定，甲醇超声溶解，定容至10 mL，取上述溶液1.0 mL置10 mL量瓶，以甲醇定容，得浓度为127.4 μg/mL的6?姜酚对照品，用0.45 μm的微孔滤膜滤过,备用。同法制备8?姜酚（82.2 μg/mL）、10?姜酚（120.5 μg/mL）对照品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验
取批号0612A?7（云南1）的干姜提取物，按“2.2.1”项下制备样品溶液，连续进样6次，进行相似度评价，结果显示相似度均大于0.99，表明精密度良好。
2.3.2 稳定性考察
取批号0612A?7（云南1）的干姜提取物溶液，按“2.2.1”项下制备样品溶液，分别在0、4、8、12、24、48 h进样，进行相似度评价，结果显示相似度均大于0.99，表明样品溶液在48h内稳定性良好。
2.3.3 重复性试验
取批号0612A?7（云南1）的干姜提取物6份，按“2.2.1”项下制备各样品溶液，分别进样，进行相似度评价，结果显示相似度均大于0.99，表明重复性良好。
2.4 干姜提取物指纹图谱的测定
精密吸取对照品溶液及10批供试品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件分别进样。将10批干姜提取物的高效液相色谱数据载入相似度评价软件，经软件分析确定了10个共有峰作为评价指标，建立了10批干姜提取物的指纹图谱（相似度评价结果见表2，图2），并生成HPLC参照指纹图（图3）。结果显示干姜提取物在225 nm下的共有峰峰面积之和占总峰面积的90％以上。本品的指纹图谱与共有模式图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》比较，相似系数均不低于0.90。
图2 干姜提取物指纹图的相似度评价结果（略）
Fig.2 The similarity evaluation of fingerprint of extraction from rhizoma zingibers
表2 干姜提取物指纹图谱的相似度评价结果（略）
Tab.2 The similarity evaluation of fingerprint of extraction from rhizoma zingibers
图3 干姜提取物的HPLC参照指纹图谱（略）
Fig.3 Consult HPLC chromatogram of extraction from rhizoma zingibers
2.5 干姜提取物指纹图共有峰的确认
本品的指纹图谱与共有模式图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》确定共有峰10个，其中1号峰为6?姜酚，2号峰为8?姜酚，4号峰为10?姜酚，对照品色谱图见图4。
3 讨论
干姜是应用广泛的常用中药材，2005年版药典以挥发油含量作为其质量评价指标。而干姜中的酚类成分是干姜的主要有效成分，本文应用HPLC法分析干姜提取物，确定其中3种酚类成分作为主要质量评价指标，并制定了干姜超临界提取物的HPLC指纹图谱，对进一步完善干姜的质量评价有一定的意义。
此外，干姜的种植范围较为广泛，云南和山东产量较大，其他省份如广东也有大面积种植。本研究分析了广东、河南、山东、云南产地干姜提取物的HPLC指纹图谱，经相似度评价软件计算相似度均大于0.9，可以认为4个产地的干姜质量相近。本研究为干姜药材的真伪鉴别及购买产地提供依据，也可对干姜超临界提取物的质量进行评价。
A.6?姜酚；B.8?姜酚;C.10?姜酚
图4 对照品色谱图（略）
Fig.4 HPLC chromatograms of reference substance
【】
［1］ 江苏新医学院.中药大辞典（上册）［M］.上海：上海技术出版社，1986：71.
［2］ 中国医学科学院药物研究所.中药志：第二册［M］.北京：人民卫生出版社,1993：228.
［3］ 孟青，冯毅凡，郭晓玲，等.干姜超临界CO2提取物质量控制的研究［J］.中国中药杂志，2005，30（1）：751-752.
