两株肿瘤细胞系HLA?I类分子基因表达水平的鉴定及意义
作者：关德莹，沈晗，邵红伟，黄树林
【摘要】 目的 探讨两株常见肿瘤细胞系Hela细胞和BEL?7402细胞HLA?I类分子基因表达水平及其影响CTL反应性的可能意义。方法 提取肿瘤细胞的基因组DNA，利用PCR反应在基因组水平鉴定HLA?I类分子基因的拷贝数情况；提取细胞总RNA， RT?PCR反应合成cDNA，利用PCR反应鉴定肿瘤细胞HLA?I类分子在RNA水平的表达情况。结果 两株肿瘤细胞的HLA?I类基因在基因组水平的拷贝数无明显下降；在RNA水平上，Hela细胞的HLA?A、HLA?B和HLA?C基因均有表达，表达水平无明显下降，BEL?7402细胞的HLA?A和HLA?C基因有表达，但HLA?C基因表达水平降低，而HLA?B基因未见明显表达。 结论 RNA水平上，部分HLA?I类分子基因表达的降低或缺失推测可能是导致BEL?7402细胞比Hela细胞出现CTL反应性下降的原因之一。
【关键词】 HLA?I类分子；Hela细胞；BEL?7402细胞；mRNA
Abstract:Objective To investigate the expression level of HLA?I molecule genes in two tumor cell lines, Hela and BEL?7402 and the possible significance of CTL reactions.Methods Genome DNA were extracted from these two tumor lines for detecting the HLA?I molecule genes′ levels by PCR.Total RNA from two cell lines were extracted for RT?PCR, HLA?I molecule genes′expression on RNA level were judged by PCR and agarose gel electrophoresis.Results HLA?I molecule genes levels did not decrease significantly on genome level.On RNA level, HLA?A, HLA?B and HLA?C all expressed normally without significant descent in Hela cell line.The expression of HLA?A and HLA?C were both detected in BEL?7402 cell line, but the expression of HLA?C gene showed significant decease, and no expression of HLA?B gene were detected on RNA level.Conclusion At RNA level, reduction or absence HLA?I molecule genes′ expression of Hela cell line were not found, however, the partial descent and absence of HLA?I molecule genes′ expression in BEL?7402 cell line was the possible reason for the reduction of CTL reaction.
Key words:HLA?I molecule；Hela cell line ；BEL?7402 cell line；mRNA
人类主要组织相容性复合物（MHC），又称为人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA )系统，位于第6号染色体短臂（6p21.31）约3.6Mb［1］，按功能差别可大致分为HLA?I类分子和HLA?II类分子两大类，其中HLA?I类分子在机体的细胞免疫中发挥重要作用。研究发现，抗肿瘤免疫的核心是机体针对肿瘤的细胞免疫反应，其中CD8+CTL细胞必需依靠肿瘤自身HLA?I类分子呈递的肿瘤抗原才能得以活化发挥杀伤作用。但由于肿瘤细胞的遗传不稳定性，会导致HLA?I类分子的表达下降或缺失，是引起肿瘤免疫耐受形成的重要原因［2, 3］。因此，了解肿瘤细胞的HLA?I类分子表达情况对研究如何打破免疫耐受，开展过继性细胞学十分必要。在前期通过CTL杀伤实验的研究中发现，CTL对本室保藏的人宫颈癌细胞Hela的杀伤活性要高于人肝癌细胞株BEL?7402(结果未发表)，为探讨此现象的发生是不是涉及到了肿瘤细胞HLA?I类分子基因的表达变化，本文在基因组水平及RNA水平对两株肿瘤细胞的HLA?I类分子基因的表达情况进行了鉴定分析，现报道如下。
1 材料与方法
1．1 细胞
Hela细胞、BEL?7402细胞均为广东药学院生物制药研究所保藏，健康人外周血由广州市血液中心提供，用人淋巴细胞分离液分离出单个核细胞。
1．2 主要试剂与仪器
RPM1640培养基、胎牛血清购置Gibico公司；T4连接酶、M?MLV反转录酶、Taq酶、dNTP、RNaseInhibitor、Oligod T均购自Fermentas公司；Trizol 0020购自Invitrogen公司；DEPC购自Sigma公司；DNA Marker DL 2000、100购自Biotech公司，基因组DNA提取试剂盒购自Pearl公司；PCR仪（Whatman Biometra，T?Gradient Thermoblock型）；电泳仪（Bio?RAD，Power Pac 300型）；凝胶成像系统（Tanon 4100型）。
1．3 细胞基因组DNA的提取
收集传代培养24 h的Hela细胞和BEL?7402细胞，细胞数约为2×106，按照基因组DNA提取试剂盒的使用说明进行操作，将提取获得的DNA进行0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。按相同方法，提取健康人外周血单个核细胞（PBMC）的基因组DNA作为对照。
1．4 PCR反应鉴定基因组水平HLA?I基因的拷贝数情况
根据GenBank中已公布的人HLA?I类基因HLA?A、HLA?B和HLA?C核酸序列，共设计3对通用PCR反应引物，并设计1对针对GAPDH基因组序列的内参引物，委托广州英骏公司合成，4对引物序列具体为：
PGA1:5′?cctctgyggggagaagcaa?3′，PGA2:5′?gac tcagaagtgctggactc?3′；
PGB1:5′?gggaggagcgaggggaccscag?3′，PGB2:5′?ggaggccatccccggcgacctat?3′；
PGC1:5′?agcgaggkgcccgcccggcga?3′，PGC2:5′?ggagatggggaaggctccccact?3′；
PGG1:5′?aaggtcggagtcaacgg?3′，PGG2:5′?atc tcgggcgggaatag?3′
用50 μL反应体系进行扩增，其参数为：95 ℃预变性3 min后，按95 ℃ 25 s、60 ℃ 30 s、72℃ 80 s进行8个循环反应，然后按照95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s进行30个循环反应，最后延伸7 min。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。
1．5 RT?PCR反应鉴定RNA水平HLA?I基因的表达情况
分别收集3×106Hela细胞、BEL?7402细胞及健康人外周血单个核细胞，按 Trizol Reagent使用说明进行抽提细胞总RNA，以RNA为模板进行逆转录PCR反应，反应体系中加入10 mmol/L的dNTPs 2 μL、RNaseInhibitor 20 U、OligodT 0.3 μg、RNA模板6 μL、5×Buffer 8 μL、M?MLV逆转录酶200 U，加无菌去离子水至终体积40 μL。混匀后42 ℃反应60 min，最后90 ℃5 min灭活M?MLV活性，4 ℃保存合成的cDNA。
扩增HLA?A、B、C 3个基因及内参GAPDH基因的引物均由Invitrogen公司合成。具体序列如下：
PRA1:5′?gacgacacgcagttcgtgc?3′,PRA2：5′?ttg gaccgcggcggacatg?3′；
PRB1：5′?accagagcgaggccgggt?3′，PRB2：5′?ctg gaccgccgcggacac?3′；
PRC1：5′?cgccgcgagtccgagagg?3′，PRC2：5′?ctg gaccgccgcggacac?3′；
PRG1：5′?aggtcggagtcaacggatttg?3′，PRG2:5′?gtg atggcatggactgtggt?3′
用50 μL反应体系进行扩增，其参数为：94 ℃预变性3 min，按94 ℃ 60 s，55℃ 40 s，72℃ 60 s进行35个循环反应。
2 结果
2．1 基因组DNA的提取鉴定
0.8%的琼脂糖凝胶电泳结果显示试剂盒法提取的Hela细胞、BEL?7402细胞及健康人PBMC基因组DNA条带明亮，无明显托尾，能满足作为PCR反应扩增模板的需要，见图1。
M.DNA marker; A.PBMC of healthy people; B.Hela cell; C.BEL?7402 cell
图1 基因组DNA凝胶电泳（略）
Fig.1 Gel electrophoresis analysis of genome DNA
2．2 HLA?I类基因在基因组水平拷贝数情况的鉴定
利用特异性PCR引物进行PCR反应检测基因组水平HLA?I类基因的拷贝数情况，结果见图2，Hela细胞和BEL?7402细胞的HLA?I类基因（HLA?A、B、C）在基因组水平的表达与健康人PBMC无明显差别。
2．3 细胞总RNA提取鉴定
从Hela细胞和BEL?7402细胞中，提取出总RNA， 1%琼脂糖电泳鉴定 。结果显示提取的总RNA有3条带，从上至下分别为28 s，18 s，5 s，其中18 s和28 s这2条带的RNA亮度明显高于5 s带，证明RNA降解较少，所提取RNA质量较高，能满足下一步RT?PCR反应的需要，见图3。
M.DNA marker; 1.HLA?A gene of healthy people; 2.HLA?A gene of Hela; 3.HLA?A gene of BEL?7402; 4.HLA?B gene of healthy people; 5.HLA?B gene of Hela; 6.HLA?B gene of BEL?7402; 7.HLA?C gene of healthy people; 8.HLA?C gene of Hela; 9.HLA?C gene of BEL?7402; 10.GAPDH gene of healthy people; 11.GAPDH gene of Hela; 12.GAPDH gene of BEL?7402.
图2 基因组水平HLA?I基因PCR结果（略）
Fig.2 PCR Results of HLA?I gene at genome level
A.Hela cell B.BEL?7402 cell
图3 肿瘤细胞RNA凝胶电泳图（略）
Fig.3 Gel electrophoresis of the RNA of tumor cells
2．4 HLA?I类基因在RNA水平上的表达情况
2．4．1 Hela细胞HLA?I类基因的表达 以Hela细胞cDNA为模板，进行HLA?I类基因的PCR扩增，2%的琼脂糖凝胶电泳结果显示Hela细胞HLA?A、HLA?B和HLA?C 3基因都扩增出比较明亮的DNA条带，对照组健康人PBMC无明显差异，见图4中2,5,8,11泳道。
2．4．2 BEL?7402细胞HLA?I类基因的表达 利用2%的琼脂糖凝胶电泳对BEL?7402细胞HLA?I类基因扩增情况进行鉴定，结果显示HLA?A基因的扩增条带较明亮与对照组无明显差别，HLA?C基因的扩增条带亮度较对照组有明显的降低，而HLA?B基因未见DNA条带扩增出来，见图4中3，6，9，12泳道。
3 讨论
人类主要组织相容性复合物（MHC），又称为人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA )系统是一个很大的基因家族，在脊椎动物适应性免疫应答中起关键作用。在机体的肿瘤免疫应答过程中，HLA?I类分子限制的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)发挥着重要作用，肿瘤免疫应答刺激信号的产生主要涉及到MHC?抗原肽?TCR三原体结构的生成［4］。
M.DNA marker; 1.HLA?A gene of healthy people; 2.HLA?A gene of Hela; 3.HLA?A gene of BEL?7402; 4.HLA?B gene of healthy people; 5.HLA?B gene of Hela; 6.HLA?B gene of BEL?7402; 7.HLA?C gene of healthy people; 8.HLA?C gene of Hela; 9.HLA?C gene of BEL?7402; 10.GAPDH gene of healthy people; 11.GAPDH gene of Hela; 12.GAPDH gene of BEL?7402.
图4 RNA水平HLA?I基因PCR结果（略）
Fig.4 PCR Results of HLA?I gene at RNA level
HLA?I类分子的表达异常是发生肿瘤免疫逃逸，形成免疫耐受的重要机制。研究发现，在很多肿瘤细胞中都存在着HLA基因丢失或表达下调的现象。有研究利用免疫组化检测证实，25％～75％的恶性肿瘤细胞有不同形式的HLAI类分子表型改变，从 HLA?I类分子阳性上皮细胞衍生的肿瘤细胞中，39％～88％存在 HLAI类分子的表达下降或丢失，而正常细胞均表现为 HLA?I类分子阳性。以上数据证明肿瘤细胞的HLA?I类分子的表达降低或缺失是恶性肿瘤的一个较为普遍的病理性改变，是肿瘤区别正常组织的一项重要指标［5］。
在前期研究中，我们利用CTL对人卵巢癌细胞株Hela细胞和人肝癌细胞株BEL?7402细胞进行细胞杀伤活性实验，MTT及细胞因子释放等结果证实Hela细胞表现出比BEL?7402细胞更高的CLT反应性（结果未发表）,为了证实肿瘤细胞HLA?I类分子基因表达的下降或缺失是否是导致这种CTL反应差异性的原因，本研究主要从基因组和RNA两个水平，探讨这两株肿瘤细胞HLA?I类分子基因的表达情况。利用特异性引物PCR反应的方法，证实在基因组水平上，Hela细胞和BEL?7402细胞的HLA?I类分子基因的拷贝数与健康人PBMC无明显差别。在RNA水平上，Hela细胞HLA?I类基因的转录水平与健康人细胞相比无明显下降；BEL?7402细胞HLA?A基因的转录水平也无明显降低，但其HLA?B和HLA?C基因的表达出现明显变化，HLA?C基因的转录水平较对照组明显降低，而HLA?B基因的转录产物不能用RT?PCR的方法检测到，表现为表达的完全缺失。以上研究结果证实，RNA水平上BEL?7402细胞的HLA?C基因表达降低和HLA?B基因表达缺失，而Hela细胞未出现明显的HLA?I 类分子表达降低和缺失，这可能是BEL?7402细胞发生免疫逃逸，引起CLT反应性下降的原因之一［6］。
本研究从基因组和RNA两个水平验证了2株细胞的HLA?I 类基因表达情况，有些肿瘤发生的HLA表达异常可能存在于HLA?I类分子蛋白合成阶段［7］，因此，要更全面地了解肿瘤细胞HLA?I 类基因的表达情况，还需要在HLA分子蛋白表达水平上进行进一步检测。
【】
［1］ CAMPOLI M, CHANG C C, FERRONE S.HLA class I antigen loss, tumor immune escape and immune selection［J］.Vaccine, 2002, 20:40.
［2］ KASS R, BELLONE S, PALMIERI M, et al.Restoration of tumor?specific HLA class I restricted cytotoxicity in tumor infiltrating lymphocytes of advanced breast cancer patients by in vitro stimulation with tumor antigen?pulsed autologous dendritic cells［J］.Breast Cancer Res Treat, 2003, 80(3): 275.
［3］ JON A, WEIDANZ, TIFFANY N, et al.Levels of specific peptide?HLA class I complex predicts tumor cell susceptibility to CTL killing［J］.J Immunol, 2006, 177: 5088.
［4］ WILLIAMS A, PEH C A, ELLIOTT T.The cell biology of MHC class I antigenpresentation ［J］.Tissue Antigens, 2002, 59:3.
［5］ CABRERA T, MALENO I, COLLADO A, et al.Analysis of HLA class I alterations in tumors: choosing a strategy based on known patterns of underlying molecular mechanisms［J］.Tissue Antigens, 2007, 69(1): 264.
［6］ SAVAGE P, COWBURN P, CLAYTON A, et al.Induction of viral and tumour specific CTL responses using antibody targeted HLA class I peptide complexes［J］.Br J Cancer, 2002, 86(8): 1336.
［7］ RODRIGUEZ T, APTSIAURI N, MENDEZ R, et al.Different mechanisms can lead to the same altered HLA class I phenotype in tumors［J］.Tissue Antigens, 2007, 69(Suppl 1): 259.
