石榴皮对红细胞膜脂质过氧化的保护作用
作者：周本宏，王慧媛，吴玥，冯琪，刘春，张杰
【摘要】 目的 研究石榴(Punica granatum L.)皮提取物对红细胞膜脂质过氧化损伤的保护作用。方法 采用3种活性氧产生体系诱发脂质过氧化为实验模型，设立模型对照组（MC）、正常对照组（NC）以及3个石榴皮提取物给药组，观察比较各组的丙二醛（MDA）含量。结果 同MC组相比，三组石榴皮提取物对黄嘌呤－黄嘌呤氧化酶系统、H2O2及UV照射3种方法引起的细胞膜脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的生成增加均有抑制作用，且有一定的剂量依赖关系。结论 石榴皮对自由基引起的细胞膜脂质过氧化损伤有保护作用。
【关键词】 石榴；红细胞膜；脂质过氧化
Abstract:Objective To investigate the protective effect of pomegranate pericarps (Punica granatum L.)on lipid peroxidation damage of erythrocyte membrane. Methods Model of lipid peroxidation of erythrocyte membrane was made by three kinds of radicals generation systems， xanthine（Xan）?xanthine oxidase(XO) system, H2O2 , and UV light.Observation was made on the content of malondialdehyde (MDA). Results Compared with MC group, the increases of MDA content in the membrane induced by Xan?XO system, H2O2 or UV light in all of the three Punica granatum L.group were inhibited dose?dependently.Conclusion Punica granatum L.may protect erythrocyte membrane from the lipid peroxidative damage induced by radicals.
Key words: Punica granatum L; erythrocyte membrane; lipid peroxidation
脂质过氧化发生在需氧细胞中，是分子态的氧与不饱和脂肪酸作用的过程；自由基被证明广泛地参与脂质过氧化过程。细胞膜因富含饱和脂肪酸最易受自由基攻击，自由基对细胞膜的损伤主要是产生脂质过氧化反应，引起膜结构和功能的改变，从而影响甚至损伤机体的功能而引起一系列疾病。如有报道指明活性氧自由基与哮喘、发热、关节炎、帕金森综合征、唐氏症、痴呆等疾病的发生有关［1］。自由基清除剂作为抗氧化剂，可以防止脂质过氧化的发生，从而预防机体因自由基产生的病变。许多陆生植物的次级代谢产物都可以作为抗氧化剂，特别是带有酚羟基的物质，如黄酮、鞣质、香豆素等［2,3］。
石榴(Punica granatum L.)是我国已知的最早的可食用的植物之一，在我国被广泛的种植。我国5个最有影响的石榴产区分别是：山西临潼、山东枣庄、安徽怀远、四川会理、云南蒙自。石榴皮是石榴科石榴属落叶灌木或小乔木石榴的干燥果皮，在中药中它被用来痢疾、细菌感染、腹泻、寄生虫病及出血等疾病。近来又有报道指出石榴皮还有杀精子［4］及抗淋球菌的作用［5］。因为石榴皮中主要含有鞣质，占总质量的10.4%～21.3%，多酚类化合物已被证明具有清除自由基的作用，所以石榴皮可能具有清除自由基而抗氧化的作用。
本实验用2种方法研究不同鞣质含量的石榴皮提取物对大鼠红细胞膜氧化损伤的保护作用。脂质过氧化物可分解产生丙二醛（MDA），本实验用MDA的量来衡量脂质过氧化的程度。实验采用3个不同浓度的给药组来研究抗氧化性和剂量的效应关系。
1 材料
UV?2800紫外分光光度计（Unico上海仪器有限公司）；高速冷冻离心机（3K30 Sigma 公司）；冷冻干燥机（Christ ALPHA 1?4）；大白兔，武汉大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2003-0004；石榴皮（购自武汉市药材公司，经武汉大学药学院张洪教授鉴定为石榴科石榴属石榴的果皮）；黄嘌呤（Xan）和黄嘌呤氧化酶（XO）（Sigma公司）；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒和丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；其他试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 实验药物的制备
称取一定量石榴皮，粉碎，用3倍量的70％的丙酮在室温下浸渍约6 h，再超声30 min，滤取滤液。其残渣再重复以上操作3次，将滤液合并，浓缩，冷冻干燥，制成粉末。
2.2 红细胞膜的制备
兔全血在0～4 ℃用低渗溶血法制备［6］，膜蛋白含量用考马斯亮兰试剂盒测定，得膜蛋白浓度0.7778 g/L。
2.3 Xan?XO 体系诱导细胞膜脂质过氧化
反应终体积为1.0 mL。各取制得的红细胞膜0.5 mL，分别加待测药物0.1 mL（MC和NC组加pH7.4磷酸盐缓冲液），置37 ℃水浴15 min，再加1.0 mmoL/L的Xan溶液0.3 mL，0.4 U/mL的 XO 0.1 mL, 立即将反应管置37 ℃水浴1 h待测。对照组、空白组、0.3 mg/mL剂量组、0.5 mg/mL剂量组、1 mg/mL剂量组都分别检测12次。
2.4 UV照射诱导细胞膜脂质过氧化
反应终体积为1 mL，内含细胞膜0.5 mL及不同浓度的药物0.1 mL（MC和NC组用pH7.4磷酸盐缓冲液代替），再加入0.4 mL pH7.4的磷酸盐缓冲液，反应管置紫外灯下照射1 h后待测（MC组在同样温度下静置而不放在紫外灯下）。对照组、空白组、0.3 mg/mL剂量组、0.5 mg/mL剂量组、1 mg/mL剂量组都分别检测12次。
2.5 脂质过氧化物的检测
采用MDA试剂盒测定,测定过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）含量以反映脂质过氧化程度。
2.6 统计学处理
MDA数值采用±s表示，多组资料间的两两比较用t检验， P< 0.05为差异有显著性。
3 结果
3.1 石榴皮对Xan?XO 体系诱导兔血红细胞膜脂质过氧化的影响
图1显示，与对照组比较，0.3 mg/mL剂量组的P值<0.05,0.5 mg/mL、1 mg/mL的剂量组的P值<0.01,说明石榴皮对Xan?XO 体系诱导兔血红细胞膜脂质过氧化产生的MDA的生成有明显的抑制作用。
(*P<0.05,**P<0.01 vs model,n=6)
图1 石榴皮对Xan?XO 体系诱导兔红细胞膜脂质过氧化的影响（略）
Fig.1 Effects of P.G.extract on erythrocyte membrane lipid peroxidation induced by Xan?XO system
3.2 石榴皮对H2O2诱导兔血红细胞膜脂质过氧化的影响
图2显示，与对照组比较，0.3 mg/mL剂量组的P值<0.05,0.5 mg/mL、1 mg/mL剂量组的P值<0.01,说明石榴皮对H2O2诱导兔血红细胞膜脂质过氧化产生的MDA的生成有明显的抑制作用。
(*P<0.05,**P<0.01 vs model,n=6)
图2 石榴皮对H2O2诱导兔红细胞膜脂质过氧化的影响（略）
Fig.2 Effects of P.G.extract on erythrocyte membrane lipid peroxidation induced by H2O2 system
3.3 石榴皮对紫外线（UV?light）诱导兔血红细胞膜脂质过氧化的影响
图3显示，与对照组比较，0.3 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL的剂量组的P值均<0.01,说明石榴皮对紫外线（UV?light）诱导兔血红细胞膜脂质过氧化产生的MDA的形成有明显的抑制作用。
(*P<0.05,**P<0.01 vs model,n=6)
图3 石榴皮对UV?light诱导兔红细胞膜脂质过氧化的影响（略）
Fig.3 Effects of P.G.extract on erythrocyte membrane lipid peroxidation induced by UV?light
4 讨论
氧自由基可多方面氧化细胞，如细胞中的脂质、蛋白及DNA。因为细胞膜由脂质双分子层组成，所以细胞膜很容易被氧自由基攻击而发生过氧化。这些过氧化过程会产生很多的产物，如乙醛、过氧化氢及自由基等。
脂质过氧化过程会造成细胞膜的损伤［7］，从而会对细胞的生命活动造成直接的损害。除此之外，过氧化物分解产物还会和细胞内物质发生次级反应，进一步损伤机体，可使DNA发生变异等［8，9］。脂质过氧化物是自由基作用于多不饱和脂肪酸的产物，其含量与自由基的浓度成正比。脂质过氧化物（LPO）在稀酸中加热降解为丙二醛（MDA），MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，该产物在532 nm处有最大吸收峰。本试验采用的MDA试剂盒可以准确地反映出亚细胞水平的脂质过氧化量［10］。
本实验为了观察石榴皮提取液及其冻干粉对抗细胞膜脂质过氧化的作用，采用了2种诱导氧化损伤体系，分别通过不同的机制产生自由基：在Xan?XO系统中，Xan在XO的催化下产生了超氧阴离子自由基（O2-·）：Xan+2O2+H2O→尿酸＋O2-＋2H+。近年有学者应用顺磁共振（ERS）技术检测到该体系有O2-·生成；而紫外线照射可使细胞膜悬液中的H2O2、O2和其它生物分子中的电子从低能轨道跃迁到高能轨道，称为激发态分子，后者迅速分解成·OH、O2-·和生物分子自由基。本实验采用的2个损伤体系［11］中产生的自由基种类和损伤机制是有一定差异的，但石榴皮均能抑制脂质过氧化的形成，说明它们的保护机制是多途径的，是非特异性的自由基清除剂，其确切机理有待进一步研究。
本实验显示，石榴皮提取液及其冻干粉可以显著抑制MDA的生成，这表明它们有阻止自由基生成或是清除自由基的作用。从而进一步表明石榴皮提取物有抗氧化和保护细胞膜的作用。
实验数据表明，石榴皮提取物冻干粉较提取液有更强的抗氧化活性。这可能是因为冻干粉中的鞣质含量较高的原因，而鞣质在本实验中是主要的抗氧化活性物质。但也不排除黄酮这种也有抗氧化的物质对实验结果产生正面影响。
本研究结果可能对由自由基引起的疾病的有一定的积极作用。石榴皮对自由基的作用，从本实验看来并不是特异性的，所以还需要通过更多的动物体内外实验进一步研究石榴皮的抗氧化活性。
【】
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