用庆大霉素抗性筛选法选育西罗莫司高产菌株

【摘要】  用紫外线对吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)NP03进行诱变，再采用庆大霉素抗性筛选法进行处理，剂量分别为0、0.01、0.03、0.05和0.08μg/ml，共获得113株抗性突变株，其中西罗莫司产量高于出发菌株的有51株，突变株NP03?74#的生产能力达到出发菌株的134%，且遗传特性稳定。

【关键词】  西罗莫司； 庆大霉素； 抗性筛选； 遗传稳定性

    Screening of mutant overproducing sirolimus with

    gentamicin resistance method

    Zhang Li  and  Jia Xiao?jing

    (New Drug Research and Development Center, North China Pharmaceulical Co.,  Shijiazhuang 050015)

      ABSTRACT  After the spores of Streptomyces hygroscopicus NP03 being treated with UV, as a mutagen one hundred thirteen sirolimus?producing strains were obtained by gentamicin resistance screening. The treatment dose was 0, 0.01, 0.03, 0.05 and 0.08μg/mg respectively. The sirolimus yields of 51 mutants were higher than that of the original strain. Among them, the yield of #NP03?74 was 134% as high as original strain′s, and the characteristic can be steadily inherited.

    KEY WORDS  Sirolimus;  Gentamicin;  Resistance screening;  Hereditary stability

   免疫抑制剂在器官移植排斥反应的预防和中有极其重要的作用。自20世纪70年代环孢素A用于临床以来，器官移植的成功率大大提高，但探求新的、安全有效的免疫抑制剂的工作一直在继续。

    西罗莫司(sirolimus)是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的大环内酯类抗生素，1977年Morris等首先发现其具有免疫抑制作用，1989年开始把西罗莫司作为治疗器官移植的排斥反应的新药进行使用，临床应用显示它具有很好的抗排斥作用，与环孢菌素A和他克莫司(FK506)等免疫抑制有良好的协同作用，是一种疗效好、低毒、无肾毒性的新型免疫抑制剂［1，2］。西罗莫司除用于器官移植抗排斥药物外，还可用于抗真菌、心血管支架涂料、新合成抗肿瘤抗生素CCI?779的原料药，预防和治疗系统性红斑狼疮、胰岛素依赖型糖尿病等，应用前途广泛。

    本文报道用庆大霉素对西罗莫司产生菌进行处理，以获得高产的抗性菌株。

    1  材料与方法

    1.1  出发菌株

    吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)NP03(本实验室保存)。

    1.2  培养基

    分离培养基(%)  酵母膏0.1，牛肉膏0.1，葡萄糖1.0，琼脂1.5。

    斜面培养基  天门冬素琼脂培养基。

    种子培养基(%)  淀粉2.0，葡萄糖0.5，酵母粉0.5，蛋白胨0.3；pH。

    发酵培养基(%)  葡萄糖3.0，黄豆饼粉3.0，硫酸铵0.5，淀粉1.0，碳酸钙0.3；pH自然。

    1.3  主要仪器

    旋转式摇瓶机，高速离心机，Waters高效液相色谱仪。1.4  菌种的选育方法

    (1)制备单孢子悬液  取NP03菌株的新鲜斜面，加无菌水制成孢子悬液，脱脂棉过滤，收集单孢子悬液，调整其浓度为106个/ml。

    (2)诱变处理

    紫外线诱变  将其孢子悬液置于15W紫外灯40cm处分别照射0、10、20和30s，然后稀释分离，培养。计数并统计致死率，确定紫外处理时间。

    庆大霉素抗性突变株的筛选  将用紫外诱变过的孢子悬液稀释成不同浓度，分别涂布在含有0、0.01、0.03、0.05和0.08μg/ml庆大霉素的分离培养基中，28℃培养10～16d，计数，统计致死率；挑取不同浓度下及对照组的菌落，培养后进行摇瓶初筛和复筛。

    1.5  效价测定

    高压液相外标法。

    2  结果与分析

    2.1  最佳照射剂量的选择

    考察紫外线照射时间对菌株致死率的影响(Tab.1)。

    紫外线有较强的杀菌能力和诱变能力，从Tab.1可以看出，NP03菌株对紫外的耐受力较弱，30s的致死率几乎达到100%，20s的致死率达到75.8%，为保证有较高的筛选几率，选择20s的UV照射剂量。

    2.2  UV照射后庆大霉素剂量对菌株的影响

    由Fig.1可知NP03菌株对庆大霉素比较敏感，20s紫外照射后的菌株与庆大霉素的浓度存在着剂量效应，当庆大霉素的剂量为0.01μg/ml时的致死率是90.2%，0.03μg/ml的致死率是92.5%，0.05μg/ml时致死率已为97.8%，0.08μg/ml的致死率是99.9%。

    2.3  用庆大霉素抗性筛选西罗莫司高产菌株

    出发菌株经紫外诱变和庆大霉素处理， 在选择平板上随机挑选出113个菌落，摇瓶初筛后有51株的发酵效价比出发菌株高，有2株超过原始菌株30%以上，它们的产量分布见Fig.2，其中突变株NP03?74#高出对照菌株34%，HPLC的分析图谱见Fig.3。

    2.4  高产突变株遗传稳定性的考察

    将突变株NP03?74#传4代，培养好后各代子斜面同时进行摇瓶，考察相对效价的变化。Tab.2显示该菌株传代后效价无明显变化，遗传稳定性较好。

    3  讨论

    在微生物菌种选育中，紫外线诱变处理，方法简便，效果好，被广泛采用。抗性突变株的筛选也是获得高产菌株一种有效的的育种方法。抗性突变包括抗代谢产物、抗噬菌体、抗前体及其类似物、抗重金属离子或抗特定的有毒物质［3］、抗培养基中的某些成分等。筛选的抗性突变株可以消除不利因素的抑制或阻遏作用，达到积累目的产物的作用。由于抗生素产生菌的抗性基因与抗生素合成的结构基因和调控基因紧密连锁而易发生共突变［4］，所以易获得高产突变株。丁向东［5］采用卡那霉素抗性筛选的方法，江凌等［6］采用链霉素抗性突变方法均获得了万古霉素高产突变株；强华等［7］采用庆大霉素、丝裂霉素C、红霉素、亚硝基胍处理吸水链霉素FC904原生质体，获得了用庆大霉素处理效果较好的高产菌株；胡海峰等［8］用组合庆大霉素到利福平二种抗性突变大幅度提高了FR900493产量。

    本实验室通过抗性筛选法结合传统的紫外线诱变方法可以快速、有效地获得理想的抗生素高产菌株这一思路，对吸水链霉菌NP03用紫外和庆大霉素处理后，获得了产量提高34%的高产菌株NP03?74#，且遗传性稳定。

【】
  ［1］ Stepkowski S M, Chen H, Daloze P, et al. Rapamycin, a potent immunosuppressi drug for vascularized heart, kidney, and small bowel transplantation in the rat ［J］. Transplantation,1990,51(1):22～26.

［2］ Granger D K, Cromwell J W, Chen S C, et al. Prolongation of renal allograft survival in a large animal model by oral rapamycin monotherapy ［J］. Transplantation,1995,9(2):183～186.

［3］ 曹有声，刘仲敏. 微生物学［M］. 长沙：湖南技术出版社，1998.

［4］ 王付转，梁秋霞，李宗伟，等.诱变和筛选方法在微生物育种中的应用［J］. 洛阳师范学院学报，2002，21(2)：95～99.

［5］ 丁向东. 万古霉素的研究开发［D］. 上海：上海医药工业研究院，1998.

［6］ 江凌，邬建国，陈伟伟，等. 链霉素抗性突变——万古霉素高产菌株的选育研究［J］. 抗生素杂志，2005，30(2)：70～72.

［7］ 强华，黄捷，陈贻锴，等. 抗生素、亚硝基胍处理吸水链霉素FC904原生质体对雷帕霉素产量的影响［J］. 福建医科大学学报，1999，33(3)：289～292.

［8］ 胡海峰，张琴，朱宝朱，等. 组合庆大霉素和利福平抗性突变提高蜡状芽孢杆菌2045合成抗生素FR?900493的水平［J］. 中国抗生素杂志，2003，28(1)：53～54.