桂枝汤对脾虚大鼠NFAT mRNA，IL?4 mRNA，IFN?γ mRNA的干预作用

【摘要】  目的：采用RT?PCR方法来探讨桂枝汤对脾虚NFAT mRNA，IL?4 mRNA，IFN?γ mRNA的影响以及干预Th1/Th2细胞漂移的机制. 方法：40只大鼠随机分为空白对照组(A组)、脾虚组(B组)、桂枝汤大剂量组(C组)和桂枝汤小剂量组(D组)等4组，每组10只；用规范的脾气虚证大鼠模型造模方法将B，C和D组大鼠造模，B，C和D组分别用蒸馏水、 桂枝汤大剂量、 桂枝汤小剂量灌胃，标本采集后用RT?PCR检测NFAT mRNA， IL?4 mRNA和IFN?γ mRNA表达水平. 结果：脾虚组的NFAT mRNA，IL?4 mRNA表达上调；而IFN?γ mRNA表达下调，经桂枝汤大、小剂量组后，NFAT mRNA，IL?4 mRNA表达下调，IFN?γ mRNA表达上调. 结论：桂枝汤对Th1/Th2细胞漂移作用途径可能是通过下调NFAT mRNA的表达，恢复了IFN?γ mRNA正常转录水平，进而下调IL?4 mRNA的表达，使脾虚大鼠Th1/Th2细胞达到一种新的平衡.

【关键词】  桂枝汤；活化T细胞核因子；白细胞介素?4；γ干扰素

      0引言

    医学表明，在生理条件下，Th1细胞和Th2细胞分泌的两类因子互相调整，相互制约，处于一种动态平衡状态. 一旦两者平衡失调，细胞因子作用于细胞表面相应受体，活化信号转导因子(signal transducer factor, STF)，将刺激信号传至核内而发挥其基因转录的调节作用，使机体局部乃至全身发生病理反应［1］. 我们通过观察脾虚证模型动物Th1细胞、Th2细胞中具有代表性的γ干扰素(interferon?γ，IFN?γ)、白介素?4(interleuin?4，IL?4)以及T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT) mRNA的表达以及桂枝汤对三者的影响， 探讨脾虚证模型动物与Th1/Th2细胞漂移的关系以及桂枝汤对其的逆转作用.

    1材料和方法

    1.1材料SD大鼠40只， 清洁级， 雄性，体质量200~300 g，由上海实验动物中心提供. 在江西中医学院动物实验中心清结级25~27℃条件下饲养. SD大鼠在动物房适应性饲养1 wk后，称质量并随机分为空白对照组（A组），脾虚模型组（B组），桂枝汤大剂量组（C组），桂枝汤小剂量组（D组），每组10只. 桂枝汤中桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣购于江西中医学院附属，按《伤寒论》原方10∶10∶7∶10∶10（W/W）配比混合药物(大枣剖开)置于烧杯中. 加入5倍蒸馏水冷浸60 min，快速加热至沸腾，而后保持微沸状态15 min，趁热抽滤，药渣中加入3倍蒸馏水，浸泡30 min，快速加热至沸，微沸10 min，趁热抽滤，弃药渣，合并滤液，水浴浓缩相当于生药1 kg/L的滤液，4℃保存. 主要试剂与仪器有卵清蛋白、刀豆蛋白A（均为Sigma公司），Trizol (GibcoBRL公司)，Rmasin, M?MLV（Promega公司），Tag酶（上海生工），并由上海生工合成引物，DNAmark(北京鼎国生物试剂公司)，PCR仪（PE480美国PERKIN ELMER公司），紫外分光光度仪（DU530美国BECKMAN公司），Eagle Eye II成像分析系统(美国).

    1.2方法

    1.2.1模型建立先按初步规范的脾气虚证大鼠模型造模方法建模［2］. 造模30 d后大鼠表现符合中医学中的脾虚症状.

    1.2.2给药除A组10只大鼠不需造模外， B，C和D组共30只大鼠按［2］方法造模30 d. A组大鼠胃饲蒸馏水2.5 mL， 2次/d，连续14 d；成模后B组大鼠灌服蒸馏水2.5 mL， 2次/d，连续14 d；成模后C组大鼠灌服桂枝汤滤液，约为6 g/kg［3］， 2次/d，连续喂药液14 d；成模后D组大鼠灌服桂枝汤滤液，约为3 g/kg，2次/d，连续喂药液14 d (C，D两组给药剂量按人与动物间体表面积折算).

    1.2.3细胞悬浊液的制备采用常规方法, 大鼠拉颈处死, 无菌条件下剪开腹腔取出脾脏研磨,在100目铜网上轻轻挤压，培养基上培育并制成细胞悬液,用低渗压除去红细胞,以Hank?s液洗涤, 配成1×1010/L及2×1010/L脾细胞悬液. 滤过后将收集的脾细胞悬液加到淋巴细胞分离液中，吸出中间灰白色细胞层，用尼龙毛柱T细胞分离法分离T淋巴细胞［4］.

    1.2.4增殖刺激重悬T淋巴细胞， 调整浓度为1×109/L，用台盼蓝染色，活性细胞＞95%，置于24孔培养板中，每孔加细胞悬液1 mL，各组内加入卵清蛋白至终浓度0.2 g/L，刀豆蛋白A  25 mg/L，37℃ 50 mL/L CO2孵箱中孵育24 h.

    1.2.5RT?PCR（逆转录）将收集培养后的细胞调成细胞悬液，用Trzol提取总RNA，紫外分光光度仪和琼脂糖电泳鉴定RNA的浓度和纯度，-70℃冻存备用. 用2 μL逆转录试剂盒逆转录合成cDNA， -70℃冻存备用. 用5 μL逆转录产物进行PCR扩增反应，并以β?actin为内对照. IL?4，IFN?γ和NFAT的引物参照报道［5-7］设计，β?actin引物参照Genebank中cDNA序列，具体序列及扩增长度见表1. β?actin反应条件：94℃ 30 s变性，50℃ 30 s退火，72℃ 3 min延伸；PCR反应条件：94℃ 5 min变性，然后35个循环的扩增，最后延伸72℃ 10 min. IFN?γ每一个循环包括94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 90 s；IL?4每一循环包括94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，NFATc每一循环包括94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min.表1PCR所有引物及扩增长度

    1.2.6PCR扩增反应半定量分析5 μL PCR产物经15 g/L琼脂糖电泳，溴化乙啶染色，能过图像分析软件读取目的电泳带A值，将目的条带与β?actin条带的比值作为目的基因mRNA的表达量，目的基因mRNA的表达量=目的条带A值/β?actin条带A值.

    统计学处理：计量资料以x±s表示，组间比较用SPSS软件包进行方差分析及SNK?q检验.

    2结果

    实验各组的 NFAT mRNA，IL?4 mRNA，IFN?γ mRNA的影响(表2). B组的NFAT mRNA， IL?4 mRNA表达上调（P<0.05）；而IFN?γ mRNA表达下调（P<0.05），经C组后，NFAT mRNA，IL?4 mRNA表达下调（P<0.05），IFN?γ mRNA表达上调（P<0.05），与正常组相比较，基本恢复了正常水平（P>0.05）. IFN?γ，IL?4，NFAT及β?actin的扩增产物经15 g/L琼脂糖电泳，所示条带分别为405,360,392和512 bp，符合设计的片段（图1～3）.表2实验各组NFAT mRNA,IL?4 mRNA及IFN?γ mRNA的表达

    3讨论

    1986年Mosman等［6］证实CD4+（T?helper,Th）可以成功能不同的Th1和Th2亚群，它们各自产生特征性细胞因子. Th1细胞主要分泌干扰素?γ(interferon?γ,IFN?γ), IL?2, IL?12等多种Th1型细胞因子；Th2细胞分泌的IL?4，IL?5，IL?10等多种Th2型细胞因子. Th1细胞和Th2细胞通过细胞因子的交互调节而互为调节细胞,从而形成复杂的细胞因子，例如由Th1细胞分泌的IFN?γ是Th1细胞分化的重要的细胞因子，它可抑制Th2细胞的分化. IL?4和IL?10是Th2细胞分化的重要的细胞因子，可抑制Th1细胞的分化［1］.

    活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)是一类与众多信号传导途径相联系，具有广泛生理功能的转录因子［8］. NFAT可以选择性诱导细胞因子和其他免疫调控基因的转录，从而在免疫应答过程中扮演着中心角色［9］.

    “脾”的防卫功能与医学免疫功能有许多相似之处，脾与免疫功能之间的关系非常密切［10］. 桂枝汤组方多以调补脾胃药为基础，桂枝汤以甘草、大枣、生姜三味药升腾脾胃清阳之气，培中土，滋化源，故可改善脾虚状况，增强人体免疫力. 桂枝汤治疗前，脾虚组的NFAT mRNA，IL?4 mRNA表达上调（P<0.05）；而IFN?γ mRNA表达下调（P<0.05），说明了脾虚大鼠Th1/Th2细胞失去了平衡，Th细胞向Th2细胞分化，Th细胞向Th1分化途径受到抑制，此时，Th2应答占优势. 其机制可能是脾虚大鼠调节因子NFAT表达上调，其通过信号传导途径阻断诱导IFN?γ的表达，解除了对IL?4表达的竞争抑制作用，从而使IFN?γ的表达下调，IL?4的表达上调；经桂枝汤大小剂量组治疗后，NFAT mRNA，IL?4 mRNA表达下调（P<0.05），IFN?γ mRNA表达上调（P<0.05），与正常组相比较，基本恢复了正常水平（P>0.05），说明了桂枝汤可以诱发Th1优势应答，抑制Th2优势应答，最终使脾虚大鼠Th1/Th2细胞达到一种新的动态平衡.

【】
  ［1］ 秦卫兵. Th1和Th2细胞在体内的分化［J］. 国外医学免疫分册，2002，25（1）：42-46.

［2］ 周永生,樊雅莉,陈小野,等. 脾气虚证动物模型规范化的初步研究-部分免疫功能方面［J］. 实验动物与管理, 2003, 20（2）：1-5.

［3］ 窦如海.实验动物和动物实验技术［M］.济南:山东科学技术出版社，2006：126.

［4］ 王兰兰. 临床免疫学和免疫检验 ［M］.北京:人民卫生出版社，2004：183.

［5］ Adachi S, Amasaki Y, Miyatake AN,et al. Successive expression and activation of NFAT family members during thymocyte differentiation［J］. Biol Chem,2000, 275(19):14708.

［6］ Kidd P. Th1/Th2 balance: The hypothesis, its limitations, and implications for health and diseases ［J］.Altern Med Rev,2003,8: 223-246.

［7］ 魏海明，刘杰，田志刚.检测Th1/Th2亚群的临床意义［J］. 中华检验医学杂志，1998，21(1)：56.

［8］ Shew JP. NFAT is responsible for tissue?specific expression［J］.Science, 1988,241:202.

［9］ 柴蔚然．活化T细胞核因子的研究进展［J］.男科学杂志,2006,20(6): 69-72.

［10］ 刘永琦.脾虚证的免疫学本质及中医药防治脾虚的免疫机制研究［J］.中国中医药信息杂志，2002,9(10):5.