大鼠骨骼肌双重神经支配收缩力及肌纤维类型的变化

              作者：刘浩，史松，白晓斌，曹永孝

【摘要】  目的: 评价神经压榨保留血运股薄肌转移肛门外括约肌成形术，用于直肠癌Miles术后肛门重建的临床应用前景. 方法: 将48只SD大鼠随机分为腓骨长肌双重神经支配组、暂时去神经支配组、去神经支配组及对照组，各行进行相应的手术操作，于术后5 mo测量肌肉收缩力，取肌肉标本进行组织学检查. 结果: 腓骨长肌双重神经支配组腓骨长肌的I型肌纤维所占比例明显增加，单收缩最大收缩时间及最大舒张时间、强直收缩的最大收缩时间明显延长. 结论: 通过接受慢肌和自身神经支配的双重神经支配，骨骼肌肌纤维构成可以发生改变，抗疲劳性改善，可替代肛门外括约肌的功能.

【关键词】  肌，骨骼；双重神经支配；肌纤维；抗疲劳性；肛门外括约肌成形术

     0引言

    动态股薄肌转移肛门成形术是直肠癌Miles术后肛门重建研究的热点［1］，但国内尚未见有神经压榨保留血运股薄肌转移肛门外括约肌成形术用于直肠癌Miles术后肛门重建的研究. 我们通过对大鼠骨骼肌兼受快肌和慢肌的双重神经支配后， 肌肉收缩力及肌纤维类型变化研究， 为神经压榨保留血运股薄肌转移肛门外括约肌成形术用于直肠癌Miles术后肛门重建提供实验依据， 并评价其在临床上的应用前景.

    1材料和方法

    1.1材料健康成年SD大鼠48只，雌雄各半，体质量200～250 g（西安大学实验动物中心）；BioLab?420型生物机能实验实时分析系统及张力换能器(JH?z204008型,50 g)均为成都泰盟科技有限公司产品；ATP酶（80 mg×1支）购于Sigma公司. 其他试剂均为国产分析纯.

    1.2方法

    1.2.1动物分组将大鼠随机分为4组，每组12只. ①腓骨长肌双重神经支配(PDIN)组：用100 g/L水合氯醛按300 mg/kg腹腔内注射麻醉. 第1次手术：大鼠俯卧位，固定四肢，常规消毒、铺无菌巾，取右下肢腘窝处纵切口，暴露比目鱼肌(SOL)、腓骨长肌及其支配的神经. 在神经进入腓骨长肌上方约3 mm处，向近端以2 mm间隔，分别以金属钳（蚊式钳）压榨三处，压榨强度为夹至血管钳满扣约5 s，夹伤（针麻仪刺激无反应）神经上方以细丝线标记. 仔细剥除SOL与腓骨长肌间的肌外膜. 切断SOL止点，将SOL远端向腓骨长肌方向靠拢，两肌肉远端成向腓骨长肌方向靠拢成锐角，两肌肉接触面约0.5 cm×1 cm,分别以细丝线间断缝合肌肉接触面的前、后缘肌外膜. 术中保护肌肉的血液供应. 第2次手术：5 mo后，麻醉方法同前，原切口暴露腓骨长肌，行肌肉收缩力测定，测定完毕后切取腓骨长肌后将大鼠处死. ②腓骨长肌暂时去神经支配(PTDN)组：操作同①，但不切断SOL止点，不剥除肌膜，不将两肌肉缝合. ③腓骨长肌去神经支配(PDN)组：操作同①，但将腓骨长肌的支配神经完全切断. ④对照组：切开皮肤后，观察肌肉的血供及神经支配，然后缝合皮肤.

    1.2.2一般观察麻醉方法同前，俯卧位，原切口暴露腓骨长肌神经夹伤近端、SOL神经、腓骨长肌. 观察肌肉的萎缩程度；用针麻仪分别刺激腓骨长肌神经夹伤近端和SOL神经，观察腓骨长肌的收缩情况.

    1.2.3肌肉收缩力的测定［2］并加以改进，制作大鼠右后肢坐骨神经-腓骨长肌标本，选用1根长约10 cm的细线缚于腓骨长肌肌腱上,将缚线另一端连接于张力换能器悬梁臂上,再将换能器固定于支架上,使肌肉处于最适初长度,用保护刺激电极给坐骨神经干进行刺激,描记波形,并记录数据. 实验中为防止神经肌肉干燥,表面持续滴注生理盐水,并注意保温,动物直肠温度维持在37℃左右. 在单刺激(波宽为0.2 ms)条件下,找到最大刺激强度,并观察肌肉单收缩的收缩幅度、最大收缩时间及最大舒张时间,引起完全性强直收缩的最小刺激频率(1000/最大收缩时间)；分别在连续单刺激(波宽为0.2 ms)2倍及5倍最大刺激强度引起完全性强直收缩的最小刺激频率条件下,观察完全性强直收缩的收缩幅度及最大收缩时间.

    1.2.4组织病检查快速切取腓骨长肌，用滤纸吸干，肉眼观察肌肉的萎缩程度，液氮冷冻，恒温冰冻切片，片厚为10 μm，行肌球蛋白ATP酶染色(pH 9.4)［3］：ATP酶孵育液20 mL临时配制: 0.1 mol/ L NaOH 7 mL, 1 mol/ L CaCl2 2 mL, 0.1 mol/L甘氨酸NaCl 10 mL,ATP酶注射液1 mL. 37℃温箱内1.5 h. 10 g/L CaCl2 6 min, 20 g/L CoCl2 6 min,水洗5 min,经硫化铵稀释液30 s,水洗5 min,最后脱水、透明、封固.

    统计学处理: 实验数据以x±s表示,采用两组比较的t检验，P<0.05为差异有显著性.

    2结果

    2.1一般状况PDIN，PTDN和PDN组分别有4，2，3只大鼠实验失败，其中有2只大鼠死于其他疾病；5只大鼠肌肉缝合部位形成明显瘢痕组织，针麻仪刺激SOL神经，肌肉无收缩反应；2只大鼠肌肉缝合部位裂开. 与对照组比较，其他3组的腓骨长肌均有不同程度的萎缩，但PDIN，PTDN组的萎缩程度明显较PDN组轻；PDIN组与PTDN组相比，萎缩程度无明显差异. 针麻仪以与第1次手术相同的强度,分别刺激第1次手术处理过的腓骨长肌神经上方及SOL神经，PDIN组可引起腓骨长肌明显收缩；PTDN组刺激腓骨长肌神经可引起腓骨长肌明显收缩，刺激SOL神经未见腓骨长肌收缩；PDN组刺激腓骨长肌神经不引起腓骨长肌收缩，刺激SOL神经可见腓骨长肌收缩；对照组刺激腓骨长肌神经可以引起腓骨长肌收缩，刺激SOL神经不引起腓骨长肌收缩.

    2.2腓骨长肌的收缩力PDIN组的腓骨长肌单收缩最大收缩时间及最大舒张时间、强直收缩的最大收缩时间明显延长（表1），与PTDN组及对照组比较有明显差异(P<0.05),但与PDN组无显著性差异；PTDN组的腓骨长肌单收缩最大收缩时间及最大舒张时间、强直收缩的最大收缩时间较PDN组为短（P<0.05），与对照组相比无差异显著性；PDN组腓骨长肌单收缩最大收缩时间及最大舒张时间、强直收缩的最大收缩时间较对照组延长（P<0.05). PDIN的腓骨长肌单收缩、强直收缩的收缩幅度较PTDN组及PDN组高（P<0.05， P<0.01）， 较对照组低（P<0.05）；PTDN组的腓骨长肌单收缩、强直收缩的收缩幅度较PDN组高（P<0.05）；PDN组的腓骨长肌单收缩、强直收缩的收缩幅度较对照组低（P<0.01）.表1大鼠腓骨长肌收缩性的变化(x±s)

    2.3腓骨长肌的组织病检查与对照组比较，PDIN组腓骨长肌I型肌纤维所占比例增加，II型肌纤维所占比例减少（图1）；PTDN组腓骨长肌肌纤维比例无明显变化；PLDN组腓骨长肌I型肌纤维所占比例增加，II型肌纤维所占比例减少. PDIN组腓骨长肌I／II型肌纤维比例较PTDN组和对照组增高（P<0.01，表2）；与PDN组比较无差异显著性. PDN组腓骨长肌I／II型肌纤维比例较PTDN组和对照组增高（P<0.01）. PTDN组腓骨长肌I／II型肌纤维比例较对照组无差异显著性.表2大鼠腓骨长肌肌纤维类型的变化(%, x±s)

    3讨论

    Miles术仍为当今公认的低位直肠癌根治的“金标准”. 然而，Miles术可能给患者的精神和心理造成巨大伤害及极度的生活不适，有的患者甚至因此而拒绝手术［4］. 目前已有多种肌肉移植重建肛门外括约肌以恢复或改善肛门控制排便的能力［5-6］，国内已将神经压榨保留血运股薄肌转移肛门外括约肌成形术用于小儿肛门失禁［7］，但国内尚未见有直肠癌Miles术后肛门重建的临床应用报道［8-9］. 股薄肌和肛门外括约肌都是横纹肌，但股薄肌的肌纤维构成主要以II型肌纤维为主，持续收缩及耐疲劳的能力较差，而来自肛门外括约肌的神经供应可以使股薄肌的酶和代谢发生改变，具有耐疲劳和持续收缩的能力：而经过神经压榨的去肌膜股薄肌一方面可以达到暂时去神经支配的状态，接受外来神经的再生和支配，建立双重神经支配；另一方面可以减轻失去神经的股薄肌的萎缩和纤维化［5-7］. 此外，移植的肌肉可以和平滑肌直接接触，肌电活动相互影响，从而使移植的股薄肌更容易达到较好的肛门外括约肌功能.

    哺乳类动物的骨骼肌按照生化和生理标准分为快收缩易疲劳的II型肌纤维和慢收缩不易疲劳的I型肌纤维. 正常情况下，骨骼肌只接受自身神经的支配，但在特定条件下可以接受外来神经的支配［10］. 我们通过神经压榨或神经离断使以II型肌纤维为主的腓骨长肌接受以I型肌纤维为主的SOL神经支配，结果发现神经压榨后的腓骨长肌可以获得来自SOL神经的支配，而且自身被压榨的神经干亦可通过再生重新支配腓骨长肌. 获得双重神经支配的腓骨长肌I型肌纤维所占构成比例明显增加，且明显延长单收缩最大收缩时间及最大舒张时间、强直收缩的最大收缩时间，增加了肌肉的抗疲劳能力，而原来压榨神经的重新支配可以降低肌肉的萎缩程度，增加肌肉收缩力. 通过完全离断自身神经获得SOL神经支配的腓骨长肌，虽然也可以实现几乎相同程度的I型肌纤维所占构成比例增加及抗疲劳的能力提高，但由于失去了原有神经支配，肌萎缩程度较明显，收缩力明显降低. 而单纯压榨自身支配神经的腓骨长肌，虽然可以通过神经再生重新获得原神经的支配，但肌纤维构成比例和抗疲劳的能力并无明显的改善.所以，通过神经压榨实现双重神经支配的腓骨长肌的效果最为理想.

    从实验结果看，获得双重神经支配的腓骨长肌的I型肌纤维类型的转化程度，从仅有25%上升至约42%，但收缩幅度与对照组相比反而降低，这与预期效果有一定的差距. 实验中为了防止肌肉过分牵拉损伤腓骨长肌的血管致肌肉坏死，腓骨长肌与SOL的接触面积仅为0.5 cm×1 cm，接触面积不充分可能为主要原因. 本实验的肌纤维类型的转化率虽较低，但从肌肉的收缩力检测结果表明，转型后的腓骨长肌收缩性确实发生了改变.

    腓骨长肌获得以I型肌纤维为主的SOL神经支配及自身神经重新支配后，表现出的肌纤维类型转型及耐疲劳能力增加的趋势，提示神经压榨保留血运股薄肌转移肛门外括约肌成形术后，股薄肌也可以实现肌纤维类型的转型、耐疲劳能力的增加. 而且通过增加肌肉的接触面积、改善手术技巧，效果会更明显. 实验证明神经压榨保留血运股薄肌转移肛门外括约肌成形术，在临床上应用于治疗直肠癌Miles术后肛门重建是可行的.

【】
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