反义抑制Survivin表达对槲皮素诱导肝癌SSMC?7721细胞凋亡的影响

                作者：李安强, 郭天康, 李荣范, 顾远晖, 蔡辉   

【摘要】  目的： 采用Survivin反义寡核苷酸(ASODN)复合物抑制survivin的表达，研究其对槲皮素诱导肝癌SSMC?7721细胞凋亡的影响. 方法：体外培养人肝癌SSMC?7721细胞，取对数生长期细胞进行实验. 实验分Ⅰ,Ⅱ两部分：Ⅰ分为空白对照组(设平行组)、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、400 μmol/L SODN复合物组、400 μmol/L ASODN复合物组(设平行组)，转染48 h; Ⅱ弃掉Ⅰ部分各组培养液，换新指定培养液，分为空白对照组、40 μmol/L槲皮素组、脂质体LipofectamineTM2000组、SODN复合物组、ASODN复合物组、ASODN复合物+ 40 μmol/L槲皮素组(联合组)，孵育细胞24 h后检测. Ⅰ结束时采用RT?PCR、细胞免疫组化染色检测各组SSMC?7721细胞survivin表达变化；Ⅱ结束时用吖啶橙染色法观察细胞凋亡时形态变化，MTT法检测SSMC?7721细胞生长抑制率，Annexi?V/PI双染流式细胞仪检测SSMC?7721细胞凋亡率. 结果：ASODN复合物作用肝癌SSMC?7721细胞48 h后能下调survivin mRNA及Survivin蛋白的表达 (P<0.01)；与其他组比较，联合组AO染色图片可观察到凋亡小体等典型的细胞凋亡形态特征变化且凋亡细胞数量明显增多，并用MTT法、Annexin?V/PI双染流式细胞仪检测显示联合组细胞的生长抑制率增高(P<0.01)、细胞凋亡率提高(P<0.01). 结论: ASODN复合物可有效抑制肝癌SSMC?7721细胞survivin基因的表达；ASODN复合物能增强槲皮素对SSMC?7721细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用即二者具有协同作用，该作用可能与抑制survivin基因的表达有关.

【关键词】  反义寡核苷酸； 槲皮素； 肝肿瘤； 细胞凋亡；细胞周期； Survivin

    0引言

    肝癌(hepatic carcinoma, HCC)是世界范围内发病率较高的恶性肿瘤之一，对于大多数肝癌患者，经肝动脉化学药物栓塞和全身化疗仍是最常用的治疗方法. 近年来抗凋亡机制在肿瘤细胞耐药性发生中的作用倍受关注［1］. survivin是1997年由Ambrosini等［2］发现，Ito等［3］报道Survivin蛋白对破坏肝癌细胞增生凋亡平衡、促进肝癌细胞快速增生具有重要作用. 槲皮素(quercetin,Quc)是广泛分布于蔬菜、水果、中草药等的一种天然的黄酮类化合物，化学名为3,3′,4′,5,7?五羟基黄酮. Lopez?Lazaro等 ［4］研究表明，Quc没有毒副作用. 近年来的研究表明Quc在体外、动物实验模型中均显示出抗癌活性［4-6］. 本实验旨在研究反义抑制survivin的表达，检测其对Quc抑制肝癌SSMC?7721生长和诱导细胞凋亡的影响，探讨反义抑制survivin的表达是否在体外可增强Quc抗癌作用及可能的机制，为其进一步动物实验和临床应用提供新的实验依据.

    1材料和方法

    1.1材料人肝癌细胞株SSMC?7721兰州大学医学实验中心提供. RPMI?1640 (Sigma公司)，小牛血清(杭州四季清公司)，槲皮素(Sigma公司,用前以少量DMSO溶解，用时加RPMI?1640稀释至使用浓度)，MTT(Sigma 公司), Trizol(BBI公司)，Survivin蛋白一抗兔抗人抗体、二抗羊抗兔抗体(北京中山公司)，TaKaRa试剂盒(宝生物工程公司)，Annexi?V/PI试剂盒(宝灵试剂公司), 阳离子脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen公司). 寡核苷酸(ODNs)?脂质体(Lip)转染复合物survivin正、反义寡核苷酸的设计、合成：根据survivin的基因序列(GenBank Accession Number U75285),应用Primer5.0软件设计互补于survivin mRNA的232-251序列的20个碱基组成的ASODN链：5′ CC C AGCCTTCCAGCTCCTTG 3′,同时合成正义链：5′ CGCAGTAGCTGCGCTGATTG 3′,两条链均采用硫代磷酸化修饰. 在GenBank中证实反义寡核苷酸(ASODN)及正义寡核苷酸(SODN)与任何已知哺乳动物基因无匹配，上海生工公司合成. 用LipofectamineTM2000输送ODNs，依［7］ ODNs/LipoTM2000=4 g/L配置ODNs? LipoTM2000转染复合物，按质脂体转染试剂盒说明书进行操作.

    1.2方法取对数生长期的SSMC?7721细胞，消化、收集、计数并接种于96孔或6孔培养板或100 mL细胞培养瓶.

    1.2.1分组实验分Ⅰ,Ⅱ两部分：Ⅰ分为空白对照组(设平行组)、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、400 μmol/L SODN复合物组、400 μmol/L ASODN复合物组(设平行组)，转染48 h; Ⅱ弃掉Ⅰ部分培养液，换新指定培养液，分为空白对照组、40 μmol/L槲皮素组、脂质体LipofectamineTM2000组、SODN复合物组、ASODN复合物组、ASODN复合物+40 μmol/L槲皮素组，孵育细胞24 h后检测.

    1.2.2RT?PCR检测SSMC?7721细胞survivin mRNA表达变化在实验Ⅰ部分结束时，按Takara试剂盒操作说明书进行，收集各组细胞，Trizol提取总RNA,用紫外分光光度计检验纯度并定量. 设β?actin为内参照，对样品模板用量标准化, survivin和β?actin分管扩增, 引物由上海生工公司合成. 其序列如下：survivin引物序列5′ AAAGAGCCAAGAACAAAATTGC 3′(F)和5′ GAGAGAGAAGCAGCCACTGTTAC 3′ (R), 338 bp; β?actin引物序列5′ CTTCTACAATGAGCTGCGTG 3′(F)和5′ TCATGAGGTA GTCAGTCAGG 3′(R), 243 bp. 10 μL逆转录体系用于逆转录合成cDNA,30℃ 10 min, 42℃ 30 min, 99℃ 5 min, 5℃ 5 min完成逆转录. 10 μL cDNA用于PCR反应,分别单独加入相应上下游引物等在50 μL PCR反应体系进行PCR反应. 94℃预变性2 min后进入PCR循环，条件：survivin和β?actin，94℃变性30 s, 54℃复性30 s, 72℃延伸30 s,共35个循环；RT?PCR产物8 μL在18 g/L琼脂糖凝胶上电泳，经凝胶图像分析仪分析结果，以survivin与β?actin的比值作为survivin mRNA表达的相对含量.

    1.2.3细胞免疫组化染色检测SSMC?7721细胞Survivin蛋白表达变化取对数生长期细胞于预先置入盖玻片6孔板进行细胞爬片，在实验Ⅰ部分处理结束时，取出各组爬片细胞，PBS液轻轻漂洗，750 mL/L乙醇固定，按试剂盒操作步骤进行细胞免疫染色. 以正常鼠血清和磷酸盐缓冲液分别代替一抗行替代对照和空白对照. 于普通光学显微镜下观察，以细胞核或细胞质出现棕褐色或棕黄色颗粒为阳性，随机选取5个高倍视野进行计数，每个高倍视野计数100个细胞，共500个细胞，细胞Survivin蛋白阳性表达率.

    1.2.4吖啶橙(AO)染色法观察细胞凋亡时形态变化消化、收集实验Ⅰ,Ⅱ两部分处理的各组细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，制成单细胞悬液，浓度1010个/L,750 mL/L乙醇固定4 h,离心弃乙醇，加入8.5 mg/L的AO 2 mL工作液，室温染10 min后，滴几滴在载玻片，加缓冲甘油封片. 在荧光显微镜下用吸收波长405 nm,发射波长550~630 nm观察，并随机拍照.

    1.2.5MTT法检测细胞增殖变化取对数生长期的SSMC?7721细胞，消化、收集、计数并接种于96孔板，每孔2×103个，并设3个复孔. 实验设数个平行板，分Ⅰ,Ⅱ两部分；到实验预定点前4 h加5 g/L的MTT 10 μL，37℃反应4 h，弃掉MTT，加200 μL DMSO,轻轻振荡10 min,使结晶溶解，酶标仪检测570 nm波长A值. 计算细胞生长抑制率(inhibitory rate，IR). 重复2次，取平均值. IR(%)=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%.

    1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡率消化、收集经实验Ⅰ,Ⅱ两部分各处理组细胞，按Annexin?V细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，加入Binding buffer缓冲液200 μL、Annexin?V/FITC (20 mg/L) 10 μL和PI液(50 mg/L) 5 μL，室温避光孵育30 min后加入Binding buffer缓冲液300 μL，立即用流式细胞仪FACScan(Beclon Dickison公司)测定，经计算机软件处理，计算凋亡细胞百分率,实验重复2遍.

    统计学处理: 实验数据以x±s表示；应用SPSS13.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析，并进行两两比较(q检验). 以P<0.05认为差异有统计学意义.

    2结果

    2.1ASODN反义复合物对肝癌SSMC772细胞survivin mRNA表达的影响RT?PCR检测survivin mRNA水平显示400 nmol/L ASODN反义复合物组(0.21±0.03)较空白对照组(0.99±0.02)、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组(0.94±0.03), 400 nmol/L SODN复合物组(0.94±0.03) RT?PCR扩增的条带减弱(P<0.01). 通过计算机图像分析结果表明，400 nmol/L ASODN反义复合物组与空白对照组、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、400 nmol/L SODN复合物组相比较差异有统计学意义(P<0.01)，其他各组间相比较差异无统计学意义.

    2.2ASODN反义复合物对肝癌SSMC772细胞Survivin蛋白表达的影响细胞免疫组化染色结果显示，400 nmol/L ASODN反义复合物组(19.7±3.7)%较空白对照组(76.5±8.7)%、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组(74.5±8.2)%,400 nmol/L SODN复合物组(73.9±7.9)% Survivin蛋白表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.01).

    2.3细胞凋亡形态学变化ASODN反义复合物联合槲皮素组凋亡细胞数量明显较空白对照组、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、SODN复合物组、ASODN复合物组及槲皮素组增加，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质成红色荧光. 凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体等典型改变(图1).

    2.4MTT法检测SSMC?7721细胞增殖变化ASODN复合物组（28.4%）或槲皮素组（43.1%）可抑SSMC?7721细胞增殖(P<0.01)， 而脂质体组（1.7%）则无此效，ASODN反义复合物联合槲皮素时表现出协同抑制细胞增殖作用（69.8%），两药联合对细胞的增殖抑制效果高于单用ASODN复合物组（28.4%，P<0.01)和槲皮素组(43.1%，P<0.01).

    2.5细胞凋亡率的变化与空白对照组、脂质体对照组相比，ASODN复合物组、槲皮素组、ASODN复合物+槲皮素组均能诱导细胞凋亡，且其诱导细胞凋亡率(Annevix(+)PI(-))分别是脂质体组的3.1倍、4.3倍、18.2倍，差异有统计学意义(P<0.01)，ASODN复合物联合槲皮素组与ASODN复合物组、槲皮素组比较，其诱导细胞凋亡率分别是他们的5.9倍、4.2倍，差异有统计学意义(P<0.01)，并且各组间流式细胞仪检测时损伤率(Annexin(+)PI(+))无统计学意义（表1）.表1各组细胞凋亡率变化

    3讨论

    Survivin的组织分布特征具有明显的选择性，其表达于胚胎和发育的胎儿组织，但不见于终末分化的成人组织(胸腺、生殖腺除外)，而表达于大多数肿瘤组织中［8-9］，使它成为一个癌的分子标志和靶点. 研究发现，Survivin能够通过杆状病毒IAP重复序列(BIR)作用于Caspase?3, Caspase?7来抑制凋亡蛋白酶活性，阻止多种凋亡信号诱导的细胞凋亡，而且能在细胞有丝分裂前期通过与纺锤体微管发生特异性结合反应，使肿瘤细胞逃避细胞周期G2/M期检测点的监控，抵抗因DNA损伤或突变自身诱导的细胞凋亡，从而导致肿瘤细胞异常分裂增殖［10］，另外Survivin蛋白亦可通过p21蛋白间接抑制caspase酶而起作用,阻断细胞的凋亡过程,其抑制细胞凋亡的作用远远大于bcl?2家族成员,是迄今发现的最强的凋亡抑制因子. Survivin的高表达可以使肿瘤细胞免受各种凋亡信号的刺激而帮助细胞存活［11-12］. 槲皮素(Quercetin)是具有多种生物活性的黄酮类化合物，其维生素P样的作用已应用于临床. 国内外已有研究显示，槲皮素是目前已知的最强的抗癌剂之一，能够诱导多种肿瘤细胞凋亡［13］，同时槲皮素还有抗炎、抗过敏、抗氧化、降血脂、降压等生理活性. 本实验应用反义核酸技术，用脂质体LipofectamineTM2000介导人工合成的特定DNA片段ASODN分子转染SSMC?7721细胞，人工合成的特定DNA片段ASODN分子与进入细胞质的survivin mRNA上的特定位点相结合，形成DNA?RNA复合物，抑制survivin mRNA与核糖体结合，同时激活RNA降解酶H，降解survivin mRNA，从而抑制或封闭基因的表达，干扰survivin致病蛋白的产生［14］. 实验结果显示， ASODN复合物作用于肝癌SSMC?7721细胞48 h后，采用RT?PCR和细胞免疫组化检测示与空白对照组比较，ASODN复合物组survivin mRNA、Survivin蛋白表达明显下调，而等量脂质体组、SODN复合物组survivin mRNA、Survivin蛋白表达变化差异则无统计学意义，实验证明了ASODN复合物可有效抑制survivin基因的表达. 实验进一步用等剂量的槲皮素(亚致死浓度)处理实验Ⅰ部分各实验组肝癌SSMC?7721细胞24 h后，实验结果显示，与其它组比较，ASODN复合物+40 μmol/L槲皮素组(联合组) AO染色法观察在相同条件联合组满视野见典型细胞凋亡形态学变化且凋亡细胞数量明显增加，MTT法、Annexin?V/PI双染流式细胞仪检测示在同等条件联合组细胞生长抑制率和细胞凋亡率明显高于其它组，差异有统计学意义. 也就是有效封闭肝癌SSMC?7721细胞survivin基因的表达能增强槲皮素对该细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用即ASODN反义复合物联合槲皮素对肝癌SSMC?7721细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用具有协同效应. 实验结果还表明，SSMC?7721细胞survivin基因表达降低后，其抗凋亡能力被有效抑制了，推测联合组对肝癌细胞的协同细胞毒性导致的凋亡可能是通过两个凋亡途径的共同通路［15］即激活Caspase效应子而实现的. 至于是通过死亡受体途径还是通过线立体途径介导的凋亡有待进一步研究.

【】
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