pten基因重组腺病毒对卵巢癌细胞生长的抑制作用

          作者：林观平,熊亮,李树梅,黄秀兰,周克元 

【摘要】  目的: 观察携带野生型pten基因的重组腺病毒(Ad?pten)体外转染高转移卵巢癌HO?8910PM细胞后的表达，并研究其对卵巢癌细胞抑制增殖、诱导凋亡和抑制迁移的作用. 方法: 利用Ad?Easy腺病毒载体系统构建Ad?pten，体外转染高转移卵巢癌HO?8910PM细胞，荧光显微镜检测Ad?pten的转染效率. Western印迹检测pten在HO?8910PM细胞中的表达；MTT实验观察pten对细胞生长的影响；HE染色法观察外源性pten基因表达对细胞形态学的影响；细胞划痕实验观察pten对细胞迁移的抑制作用；Hoechest33258凋亡染色检测pten基因对HO?8910PM细胞凋亡的诱导作用. 结果: 外源性野生型pten基因经腺病毒介导成功转入HO?8910PM细胞，Western印迹检测出有PTEN蛋白的表达，当感染复数MOI为100时，体外转染效率高达90%以上. pten显著抑制HO?8910PM细胞增殖、诱导其凋亡并能抑制其迁移. 结论: 重组腺病毒是高效的基因转移系统，能将pten目的基因高效地转移到高转移卵巢癌HO?8910PM细胞中，对细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用，并能抑制其迁移.

【关键词】  卵巢肿瘤；基因；pten基因；腺病毒；细胞凋亡；迁移抑制

     0引言

    抑癌基因pten，即第10号染色体缺失的与张力蛋白同源的基因，是继p53后又一个与多种肿瘤发生密切相关的抑癌基因，其编码具有双重特异磷酸酶活性的蛋白，可以反向调控磷脂酰肌醇(?3)激酶（phosphatidylinositol 3?kinase，PI3K）/AKt信号传导途径，从而抑制细胞生长增殖. 其突变和缺失多发于乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等［1-3］. 在某些pten基因突变或缺失的癌细胞中过表达PTEN蛋白能抑制细胞增殖和肿瘤的形成，使其细胞周期停滞在G1期并发生细胞凋亡［4-5］，而且在某些没有pten基因突变的癌细胞中,使pten基因过表达也能抑制这些癌细胞生长，诱导其发生凋亡［6］；另外，pten基因还能抑制癌细胞的侵润转移，降低其迁移能力. 这就提示pten基因用于癌症基因治疗有着重要意义. 而基因治疗载体的选择最为重要，当今运用最多最广泛的就是腺病毒(adenovirus, Ad)载体，其具有在哺乳动物及其他多种生物细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性和不整合宿主细胞的性质，是一种比较安全，转染效率又高的载体［7］. 本研究采用携带野生型pten基因的重组腺病毒(Ad?pten)，将pten基因导入人高转移卵巢癌HO?8910PM细胞，观察其在卵巢癌细胞中的表达，研究其对卵巢癌细胞生长抑制、迁移抑制、诱导凋亡的作用，对卵巢癌的基因治疗进行初步的探索并提供有意义的数据.

    1材料和方法

    1.1材料人高转移卵巢癌HO?8910PM细胞和人胚肾细胞293T购自院上海细胞生物学研究所；野生型pten表达质粒（wt?pten）为美国加州大学Frank Furnari教授惠赠；Ad?Easy腺病 毒表达载体系统由美国休斯霍华德医学院及John Hopkins肿瘤中心Bert Vogelstein教授惠赠，其中穿梭载体pAdTrack?CMV带有绿色荧光蛋白报告基因(gfp)，在表达外源基因同时也能单独表达gfp，用于重组腺病毒的快速筛选以及转染率的测定；抗PTEN抗体为美国Santa Cruz公司产品; HRP标记羊抗鼠IgG抗体和马抗山羊IgG均购自北京生物技术有限公司；MTT为美国Amerson公司产品. Hoechst33258 细胞凋亡染色试剂盒购于武汉碧云天生物技术公司.

    1.2方法

    1.2.1重组腺病毒载体的构建及细胞培养应用细菌内同源重组的方法，构建携带野生型pten基因的重组腺病毒Ad?pten及阴性对照Ad?gfp ［8］. HO?8910PM细胞培养于含100 mL/L小牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI?1640培养液中，置50 mL/L CO2, 37℃孵箱培养.

    1.2.2Ad?pten转染效率的测定取指数生长期的高转移卵巢癌HO?8910PM细胞，以5×104/孔接种于6孔培养板中，24 h后吸弃培养基，换无血清RPMI?1640培养基，用25，50，100感染复数(multiplicity of infection, MOI=病毒颗粒数/转染的细胞数)的腺病毒感染, 培养6 h后，换完全培养液继续培养. 24 h后在荧光显微镜下计数gfp阳性细胞百分率. 确定HO?8910PM细胞转染所需的MOI值，使得转染效率＞90%.

    1.2.3Western Blot检测转染细胞表达的PTEN蛋白取对数生长期细胞，按2×106接种于25 cm2培养瓶中. 常规条件培养24 h后，按MOI=100加入病毒，设Ad?pten 组和Ad?gfp 组，培养6 h后，换完全培养液继续培养. 48 h后提取细胞总蛋白；以Bradford酶标仪蛋白定量法测定蛋白含量，然后作SDS?PAGE（12 g/L），于4℃冰箱中90 mA恒流电转过夜，使目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上,封闭液于4℃封闭过夜，将膜转至新的封袋中，按0.1 mL/cm2加入适量的一抗稀释液（小鼠抗人PTEN单抗按1∶300封闭液稀释，山羊抗人Actin多抗按1∶500封闭液稀释），封口后，室温下平缓摇动反应4 h. TBS洗涤后加入二抗稀释液（PTEN, Actin的二抗均按1∶2000封闭液稀释），同条件反应1 h. 大量TBS洗涤去除未结合的二抗. ECL（化学发光）处理，暗箱中以X光胶片曝光，显影、定影.

    1.2.4MTT法测定HO?8910PM细胞增殖抑制率取对数生长期细胞，以5×103/孔接种于96孔板培养，常规条件培养24 h后，吸弃培养基，换无血清RPMI?1640培养基，按MOI=100加入病毒，设Ad?pten 组，Ad?gfp组，PBS空白对照组和本底对照组(只加完全培养液，不种细胞)，培养6 h后，换完全培养液继续培养. 每个时间点设6个平行孔，在指定时间(24,48,72 h)加入MTT (5 mg/mL) 20 μL/孔，孵育4 h后，小心吸弃孔内上清液，加入DMSO 150 μL/孔，振荡10 min，490 nm作为测定波长，570 nm作为参比波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值. 细胞增殖抑制率=［1-实验组（A570 nm-A490 nm）/本底对照组（A570 nm-A490 nm）］×100%.

    1.2.5HE染色观察细胞形态取指数生长期高转移卵巢癌HO?8910PM细胞，以5×104接种于35 mm培养皿中，24 h贴壁后，加入Ad?pten或Ad?gfp感染，并设加PBS为空白对照；病毒感染方法同1.2.4，24 h后弃培养基，生理盐水漂洗，950 mL/L乙醇固定15 min，苏木素染色3～10 min，自来水冲洗5～8 min， 5～10 mL/L盐酸酒精分化数分钟，自来水冲洗5～8 min，然后加温热水5～10 min显蓝，自来水充分冲洗，伊红复染2 min，再次用自来水充分冲洗，普通光学显微镜下观察.

    1.2.6细胞划痕试验取指数生长期高转移卵巢癌HO?8910PM细胞，按2×104/孔接种于6孔培养板，用RPMI 1640完全培养基孵育24 h后，用移液枪枪尖在细胞培养基表面划一条痕迹（长约2 cm），用PBS洗3次后加入无血清RPMI?1640培养基，病毒感染方法同1.2.4，设加PBS为空白对照，继续培养48 h后镜下观察.

    1.2.7Hoechst33258凋亡染色取对数生长期HO?8910PM细胞2×104/孔接种于6孔板，病毒感染方法同1.2.4，设加PBS为空白对照，48 h后用固定液固定10 min，PBS洗2次，Hoechst33258 染色5 min，荧光显微镜下观察.

    统计学处理: 本实验采用SAS 8.0统计软件进行统计分析，用单因素方差分析(ANOVA)， P<0.05表示差异有统计学意义.

    2结果

    2.1Ad?pten对HO?8910PM细胞体外转染效率的测定Ad?pten在体外感染人高转移卵巢癌HO?8910PM细胞具有较高的转染效率. 在MOI=100时可以达到90%以上（图1）.

    A: 荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达; B: 同一视野下光学显微镜观察.

    图1Ad?pten(MOI=100)感染HO?8910PM细胞的效果×200

    2.2Western检测转染后PTEN蛋白的表达Western印迹分析结果表明，Ad?gfp感染后的HO?8910PM细胞未见特异性条带；而Ad?pten感染后的HO?8910PM细胞，则见到特异性条带，而且Pten蛋白表达量也较高（图2）.

    图2Western Blot检测PTEN蛋白的表达

    2.3Ad?pten对HO?8910PM细胞增殖的影响以MOI=100病毒感染后24，48，72 h，通过吸光度值，Ad?pten的抑制率分别为(89.76±1.49)%, (91.11±1.38)%, (92.38±1.78)%, 而Ad?gfp感染组分别为(8.14±2.16)%, (7.82±2.32)%, (6.16±2.86)%，二者比较，差异有统计学意义（P<0.01）.

    2.4Ad?pten对HO?8910PM细胞形态的影响重组腺病毒Ad?pten感染及非病毒感染(对照)的3组HO?8910PM细胞, 经HE染色光镜下观察可见，正常对照及Ad?gfp处理组细胞成片生长，细胞间隙紧密，胞质舒展，核分裂现象明显. Ad?pten处理组细胞则细胞间隙变大，胞质红，核固缩，易见凋亡小体(图3).

    A: PBS对照组; B: Ad?gfp处理组; C: Ad?pten处理组.

    图3Ad?pten感染对HO?8910PM细胞形态的影响HE ×400

    2.5Ad?pten对HO?8910PM细胞迁移能力的影响重组腺病毒Ad?pten感染后的指数生长期高转移卵巢癌HO?8910PM细胞与对照组(PBS空白组和Ad?gfp组)比较，Ad?pten能有效地抑制HO?8910PM细胞的迁移（图4）.

    2.6Ad?pten诱导HO?8910PM细胞凋亡Hoechst 33258荧光染色结果显示, 重组腺病毒Ad?pten感染HO?8910PM细胞48 h后，Ad?pten感染组出现典型的凋亡形态学改变，可见胞体缩小、胞浆浓缩、核染色质聚集、核固缩，还可见膜包裹的凋亡小体. 而PBS对照组和Ad?gfp组的细胞均未发生形态学的改变（图5）.

    3讨论

    随着分子生物学及分子遗传学的，癌基因的激活和抑癌基因的突变失活，是目前较为公认的肿瘤发生发展的重要原因之一. 本文研究的抑癌基因pten，其突变和缺失常见于多种恶性肿瘤，与肿瘤的发生发展有着密切关系. 目前普遍使用的肿瘤的基因方法是导入外源性野生型抑癌基因补充或替代突变的抑癌基因.我们选用重组腺病毒载体导入抑A0,A1: PBS对照组; B0,B1: Ad?gfp处理组; C0,C1: Ad?pten处理组; A0, B0, C0: 0 h;  A1, B1, C1:  感染后48 h.

    癌基因pten，其极少发生插入突变，载体操作方便、宿主广泛、容易繁殖，并具有携带外源基因容量大，可表达接近翻译后成熟水平蛋白质等特点，已广泛用于多种疾病的体内基因治疗. 国外报道的Ad?Easy系统［9］除具有腺病毒载体的一般优点外，还具备以下优点：①在细菌体内完成同源重组，重组效率高，周期短；②利用含不同抗生素筛选重组子，简化了筛选工作；③经重组的腺病毒带有gfp基因，可直接通过荧光显微镜监测病毒的生成，病毒滴度的测定和对宿主细胞的转导效率的检测都较传统方法简便易行. 我们利用Ad?Easy腺病毒载体系统构建了携带野生型pten基因的重组腺病毒，导入人高转移卵巢癌HO?8910PM细胞，证实pten 基因在HO?8910PM细胞中能高效地表达. 通过MTT比色检测，发现Ad?pten 对HO?8910PM细胞具有显著的增殖抑制作用，能有效地抑制该癌细胞生长. 细胞划痕实验证明Ad?pten能有效地抑制该癌细胞的迁移. Hoechst 33258 凋亡染色结果也表明pten具有诱导该癌细胞凋亡的作用.

    本研究结果表明，携带野生型pten基因的重组腺病毒是一种高效的基因转移系统，能将pten目的基因转移到受体细胞中，对人高转移卵巢癌HO?8910PM细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导效应，并能抑制该癌细胞迁移，为进一步的基因治疗卵巢癌的研究奠定了基础.

【】
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［9］ He TC, Zhou S, Costada LT, et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 9(5):2509-2514.