RP?HPLC法测定心可舒片中葛根素的含量
【摘要】 ［目的］建立心可舒片中葛根素的HPLC含量测定方法。［方法］高效液相色谱法；色谱条件：ZORBAX Eclipse XDB?C18，柱温25摄氏；流动相：甲醇-水-磷酸（23∶77∶0.5）；流速：1.0ml.min-1;检测波长；250nm。［结果］葛根素在25ng～250ng范围内，线性关系良好，回归方程为Y=4663.9774X（r=0.9998），平均加样回收率为102.34%，RSD=2.7197%（n=5）。［结论］本方法稳定、可靠、操作简便、快速、重现性好，可用于心可舒片葛根素的质量控制。
【关键词】 心可舒片 葛根素 高效液相色谱法
Abstract:［Objective］Set up measurement method for measuring puerarin in Xinkeshu tablets with HPLC.［Method］HPLC,chromatogram:ZORBAX Eclipse XDB?C18;column temperature:25C degree;flow phase:methanol?water?phosphor（23∶77∶0.5）；flow speed:1.0ml·min-1;tested wave length:250nm.［Result］In the range of 25ng～250ng,puerarin has good linear relationship,with regress equation:Y=4663.9774X（r=0.9998）,the average pushing-sample reclaim rate is 102.34%，RSD=2.7197%（n=5）［Conclusion］The method is stable, reliable, easy to operate, quick, with good repeat, can be used in quality control of puerarin in Xinkeshu tablets.
Key words:Xinkeshu tablets; puerarin; HPLC
心可舒片是由山楂、葛根、丹参、三七、木香5味中药精制而成的纯中药制剂，具有提高耐缺氧能力，抗心肌缺血，降脂、降压、抗心律失常、促纤溶，抗血液粘稠度，活血化瘀，行气止痛等功效，主要用于气滞血瘀型冠心病引起的胸闷，心绞痛，高血压，头晕，头疼，颈项疼痛以及心律失常，高血脂等症。
心可舒片主要成分为葛根、山楂。葛根为其臣药，主要成分为大豆苷、葛根素、5，7，4`-三羊基异黄酮等黄酮成分。而葛根素具有扩张冠状动脉、增加冠状血流量的作用，对其疗效有显著的影响。因此，建立以葛根素含量为质量控制的一个指标，测定心可舒片中葛根素的含量有其实际意义。本研究拟采用RP?HPLC法建立心可舒片中葛根素的含量测定方法，作为控制心可舒片质量的一个标准。
1 仪器与试药
仪器：Agilent 1100Serise高效液相色谱系统（安捷伦科技有限公司）；DZKW?4型恒温不锈钢水浴锅（上海东星建材实验设备有限公司）；SCQ?250型超声波清洗器（上海申波超声有限公司）；PL5124型纯水机PALL；DHG?9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司）；FA?1004万分之一电子天平（上海天平仪器厂）；十万分之一电子天平；10④1玻璃注射器。试剂：葛根素标准品（含量测定用，药品生物制品检定所）；甲醇（色谱纯107065，美国Tedia公司）；95%乙醇（20041011，杭州长征化工厂）；水为过膜水（0.2④m，杭州化学试剂有限公司）；磷酸（041202，杭州化学试剂有限公司）
2 色谱条件
Agilent公司Agilent1100 Series高效液相色谱仪，ZORBAX Eclipse XDB?C18色谱柱；UVD检测器；流动相：甲醇-水-磷酸（23∶77∶0.5）；检测波长：250nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：25℃；进样量：5μl。
3 样品制备
3.1 葛根素对照品溶液的设备
精密称取葛根素对照品2.0mg置10ml容量瓶中，以30%乙醇溶解，并室温定容至刻度，摇匀，得到浓度为0.20mg·ml-1的葛根素对照品的储备液。精密吸取0.20mg·ml-1的葛根素1.00ml置5ml的容量瓶中，以30%的乙醇溶液室温定容至刻度，摇匀，得到浓度为40μl·ml-1的葛根素对照品溶液。
3.2 供试品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的心可舒片内容物0.2g，置150ml具塞锥形瓶中，加入30%的乙醇溶液50.0ml，称重。于60℃超声20min，冷却至室温以后，补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液作供试品溶液。
3.3 阴性对照溶液的制备
按处方比例称取除去葛根的其他药材适量，依照心可舒片制备工艺和供试品溶液的制备方法制备缺葛根的阴性对照液。
4 实验方法
4.1 空白实验
在上述色谱条件下，精密量取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液各5ml，分别注入色谱仪。供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，有一相同保留时间的色谱峰，而缺葛根阴性对照液在此保留时间处无色谱峰。证明其它药材及辅料对葛根素的测定无干扰。
4.2 线性关系的考察
分别精密吸取浓度为40ml·ml-1葛根素对照液0.25ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml及浓度为200mg·ml-1葛根素储备液0.50ml置2ml容量瓶中，以30%乙醇溶液室温定容至刻度，摇匀，配制得浓度为5mg·ml-1、10mg·ml-1、20mg·ml-1、40mg·ml-1、50mg·ml-1的葛根素标准系列，在上述色谱条件下，分别进样5ml进行测定。结果表明，在25ng～250ng范围内，葛根素对照品进样量与峰面积之间呈良好的线性关系。回归方程为Y=4663.9774X（r=0.9998）。该标准曲线通过原点，因此可采用外标一点法进行测定。
4.3 精密度实验
以浓度为20mg·ml-1葛根素对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，每次进样5ml，进行测定，峰面积RSD≤2%,证明仪器精密度符合要求。
4.4 稳定性实验
以心可舒供试品溶液，在上述色谱条件下，分别于0h、1h、2h、4h、6h、10h、24h进行5ml进行测定，峰面积RSD≤3%,证明心可舒公式也在24h内稳定
4.5 重复性实验
取同一批心可舒片样品（021101），按“3.2供试液的制备”项下制备6批供试液，并在上述色谱条件下进行测定。心可舒片中葛根素含量RSD≤3%,重复性符合要求。
4.6 加样回收率试验
精密称取已测得含量（去包衣干燥至恒重）的心可舒片（021101）内容物5份，每份0.05g，置150ml具塞锥瓶中，分别精确加入0.20mg·ml-1葛根素储备液3.5ml，加30%乙醇溶液21.5ml，按供试品溶液制备方法制备供试液，并在上述色谱条件下进行测定，加样回收率。葛根素含量的回收率在97.80%～105.00%之间，平均回收率102.18%，RSD2.7197%故供试液的制备对含量测定无影响。
4.7 样品的测定
取3个不同批号的心可舒片各10片，去包衣，干燥至恒重，研成粉末。精密称取干燥至恒重的心可舒片内容物0.2g，置150ml具塞锥形瓶中，加入30%乙醇溶液50ml，称重。于60摄氏度超声波20min，冷却至室温后，补足减失重量，摇匀，滤过。取续滤液1ml至50ml容量瓶内，室温定容至刻度，用微孔滤膜（0.45mm）滤过，取续滤液做供试品。在上述色谱条件下进行5μl
5 讨论
5.1 样品前处理工艺的考察
本实验分别考察了热回流和超声法对样品的提取，结果测得两种方法提取所得的葛根素峰面积相近，而后者提取杂质少，并耗时短，故本实验采用超声波提取法来制备样品。采用超声波提取法分别提取20min和30min和40min，结果三者提取心可舒片中葛根素的峰面值相近，故本实验选用超声提取20min来处理样品。分别选用30%乙醇和甲醇进行样品提取，60℃超声20min，两种溶剂提取的葛根素峰面积相近，而前者无毒性，故选用30%乙醇溶液来提取样品。
5.2 色谱条件的选择
以RP?HPLC法测定葛根素大多选择甲醇-水为流动相。《药典》2005版（一部）采用甲醇-水（25∶75）为流动相来测定葛根药材中葛根素的含量。本实验以甲醇-水（25∶75）为流动相时，样品中葛根素的相邻峰的分离度R＜1.5.以乙醇-水（20∶80）为流动相时，分离度＞1.5，但峰形不理想。在流动相中加入磷酸，峰形变尖锐，得到改善。试验了甲醇-水-磷酸（23∶77∶0.1）、甲醇-水-磷酸（23∶77∶0.2）、甲醇-水-磷酸（23∶77∶0.5）等不同流动相体系，结果以甲醇-水-磷酸（23∶77∶0.5）为流动相时，样品中葛根素与其相邻峰分离度R＞1.5，理论塔板数、拖尾因子等均符合要求，且峰值也较好。故本实验选用甲醇-水-磷酸（23∶77∶0.5）为流动相。以不同浓度葛根素对照品进行考察，分别进样5ml、10ml、20ml。进样量为20ml时，理论塔板数、拖尾因子太小，且有肩峰；进样量为10μl时，峰形呈宽峰且拖尾；进样量为5μl时，理论塔板数、拖尾因子均符合要求，且峰形比较好。故本实验选用葛根素储备液稀释5倍进样5μl。
5.3 本实验所测的不同批号的心可舒片中，葛根素的含量差异比较大。因此，在生产心可舒片过程中，要控制好原药材的质量，以控制心可舒片的质量。
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