HPLC法测定利咽合剂中黄芩苷的含量
【摘要】 建立一种可测定利咽合剂中黄芩苷含量的高效液相色谱方法。[方法]采用Hypersil—ODSC18(250mm×4.6mm 5μm)色谱柱;流动相为甲醇—1.5%磷酸10%甲醇溶液(40∶60,v/v);检测波长为276nm;流速为1.0ml/min;柱温:40℃。[结果]黄芩苷在25.74μg·ml-1~514.8μg·ml-1范围内呈良好的线性关系(r=0.9999),平均回收率为99.8%;RSD1.43%。[结论]高效液相色谱方法简便,快速,准确,可作为该制剂的质控方法。
【关键词】 利咽合剂 黄芩苷 高效液相色谱法 含量测定
Determination of the Baicalin in Pharynx Preparation by HPLC
Abstract:[Objective] It is aimed at discovering an effective way of HPLC to detect the content of baicalin in the pharynx preparation.[Method] The column of Hypersil?ODS C18:250mm × 4.6mm 5μm;the mobile phase:1.5% orthophosphoric acid and 10% methane alcohol;the detection wavelength: 276nm;velocity of flow: 1.0 ml/min;temperature: 40℃;the content is measured in the way of external standard method of apex area.[Result] By this method,baicalin takes on an excellent linearly relation within the range of 25.74μg·ml-1 ~ 514.8μg·ml-1,average recoveries get up to 99.8% and RSD 1.43% respectively.[Conclusion] This way is convenient and rapid,accurate and reliable,able to be used as a method of quality control on such baicalin preparation.
Key words:pharynx preparation;baicalin;HPLC;content detection
利咽合剂是我院中医内科根据古方及临床使用而得的经验方,处方主要由黄芩、木蝴蝶、连翘等中药组成,具有清热利咽散结、养阴生津的功效,临床上常用于外感热邪或血热所致的咽痛、咽干、咽部异物感等症。黄芩、木蝴蝶是方中的君臣之药,其主要成分均为黄芩苷[1?2]。本文采用高效液相色谱法测定利咽合剂中黄芩苷的含量,结果准确,操作方便,可用于该制剂的质量控制,现报道如下。
1 仪器与试药
日本岛津LC-2010A高效液相色谱仪,自动进样系统;Lcsolution Version 1.11SP1色谱数据工作站;日本岛津UV-2450紫外分光光度计;KQ-250B型超声波清洗器(功率:250W,频率:40KHz,昆山市超声仪器有限公司)。甲醇为色谱纯;磷酸(分析纯);水为重蒸馏水;黄芩苷对照品由药品生物制品检定所提供,批号:110753-200212。利咽合剂(均为本院制剂室生产,批号:051021、051220、060214)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil-ODSC18(250mm×4.6mm 5μm);流动相:甲醇-1.5%磷酸10%甲醇溶液(40:60,v/v);检测波长为276nm;流速:1.0ml/min,柱温:40℃。
2.2 供试品溶液的制备 (1)样品溶液的制备:精密吸取利咽合剂2ml,置100ml容量瓶中,加70%乙醇溶液稀释至刻度,滤过,取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液即得。(2)阴性空白对照溶液的制备:按其质量标准中的处方比例,制备缺味(黄芩、木蝴蝶)中药的阴性空白样品对照液,照上述样品溶液的制备方法制成阴性空白对照溶液。(3)对照品溶液的制备:精密称取黄芩苷对照品适量加70%乙醇制成1ml含黄芩苷25.74μg的对照品溶液。
2.3 系统适用性试验 取黄芩苷对照品溶液、阴性空白对照溶液和样品溶液,按上述色谱条件下进样10μl,得HPLC图谱(见图1)。理论塔板数按黄芩苷峰不应低于3000,分离度大于1.5,黄芩苷峰对称因子为0.95~1.05之间。
图1 对照品黄芩苷和样品及阴性空白对照液的HPLC图(略)
t/minA.对照品图谱 t/minB.样品图谱 t/minC.阴性空白对照品图谱
2.4 线性关系的考察 分别精密吸取对照品溶液1.0、2.0、5.0、8.0、10、15、20、25μl,注入高效液相色谱仪,按上述条件测定,记录峰面积,以峰面积(y)为纵坐标、黄芩苷进样量(x)为横坐标进行线性回归,得回归方程:Y=3.408×106X-5.299×103,r=0.9999。结果表明黄芩苷的溶液在25.74μg·ml-1~ 514.8μg·ml-1之间呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,重复进样5次,按上述色谱条件测定峰面积。结果,RSD分别为0.07%和0.10%。
2.6 重复性试验 取同一批号样品5份(批号:060214),按2.2项下样品溶液的制备方法制备供试液,平行测定,得:RSD为1.49%。说明方法重现性良好。
2.7 稳定性试验 取供试品溶液(批号:060214),分别于0,1,2,4,8,12h,各精密吸取10μl,按上述色谱条件测定峰面积,结果,RSD为0.56%。表明供试品溶液在12h内稳定。
2.8 回收率试验 精密吸取已知含量的样品2.0ml,精密加入黄芩苷对照品10ml,照供试品溶液项下操作,按上述色谱条件测定,结果见表1。
2.9 样品含量测定 分别取不同批号样品,按2.2项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品和对照品溶液各10μl,分别注入高效液相色谱仪测定,结果,黄芩苷含量分别为:2.175,1.629,1.844mg/ml。
表1 回收率测定结果(略)
3 讨论
取上述黄芩苷对照品溶液,在紫外分光光度计上于波长200nm~400nm处扫描,结果在276nm波长处有最大吸收,故以276nm为检测波长。笔者对不同系统的流动相进行了比较,结果以甲醇-1.5%磷酸10%甲醇溶液(40∶60)分离效果最好,峰形较佳故选用此为流动相。柱温虽对组分的分离度影响较小,但对样品组分的保留时间(t值)影响较大,经反复试验:柱温在40℃时既可加快分析速度,又可保持出峰时间的恒定,从而保证试验结果的重复性和准确性。
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[1] 肖培根.新编中药志[M].北京:化学出版社,2002:862.
[2] 肖培根.新编中药志[M].北京:化学工业出版社,2002:112.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2005:408.