参参康心胶囊对小鼠心肌缺血线粒体膜SOD、MDA的影响

      作者：兰云 明海霞 刘喜平 李沛清 廖湘琦

【摘要】  目的：观察参参康心胶囊对缺血小鼠心肌线粒体丙二醛、超氧化物歧化酶的影响。方法：腹腔注射垂体后叶素（Pit）造成小鼠心肌缺血损伤为模型，测定心肌线粒体膜超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量。结果：模型组与空白对照组相比，MDA明显升高（p<0.01），参参康心胶囊大、中、小三剂量组与模型组比较MDA含量明显下降，有显著性差异，但无明显的剂量-效应关系。模型组心肌细胞线粒体SOD活力略有下降，但不明显，而参参康心胶囊大剂量组SOD活力有显著增高，而中小剂量不明显。结论：参参康心胶囊保护缺血心肌细胞线粒体损伤的机理可能与升高线粒体SOD活性、降低MDA含量有关。

【关键词】  参参康心胶囊 心肌缺血 线粒体 丙二醛 超氧化物歧化酶

    氧自由基是造成心肌缺血的重要因素之一。细胞内丰富的线粒体对氧自由基损伤十分敏感[1、2]，所以通过对线粒体的代谢、结构及功能变化的研究，既可以了解心肌缺血性损伤的机制，又可以了解药物的效果。新药参参康心胶囊来源于名老中医验方，由人参等三味药物组成，经制药工艺加工而成，临床应用多年，对冠心病、心肌梗死等心肌缺血性疾病有显著疗效。为了近一步明确该方抗心肌缺血损伤的作用机制，我们观察了该药对缺血心肌线粒体膜氧自由基及脂质过氧化的影响，以期进一步了解该制剂对改善心肌缺血的作用机制，为临床治疗心肌缺血性疾病提供可靠的理论依据。

    1  材料

    1.1  实验动物  昆明种普通级健康小鼠，雌雄各半，体重30.0±2.0g，由兰州大学医学实验中心提供。动物合格证号：医动字第14—005。

    1.2  实验药物  参参康心胶囊：①处方由人参等三味药物按一定的比例组成。由兰州佛慈制药股份有限公司制备，兰州中药现代化工程技术中心监制。规格为0.5g·粒-1(每粒相当于生药1g)，实验时用生理盐水溶解为120mg生药/ml。②地奥心血康胶囊：成都地奥制药集团有限公司，批号：0503079 代号022，国药准字：Z10910051。③垂体后叶素：上海第一生化药业公司，上海生物化学制药厂，批号：041031。

    1.3  主要试剂  ①丙二醛（MDA）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20050919。②超氧化物歧化酶（SOD）测试盒，南京建成生物工程研究所，批号：20050927。

    1.4  主要仪器  天平（Sartorius BL150，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；离心机（D-37520 ,德国 ）；数显恒温水浴锅（HH-4，郑州杜甫仪器厂 ）；紫外分光光度计（UV-9100，北京瑞利分析仪器公司）。

    2  方法

    2.1  分组及小鼠心肌缺血模型的建立

    昆明种普通级健康小鼠，60只，体重30.0±2.0g，（兰州大学医学实验中心提供）。将动物随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组（地奥心血康组）、参参康心胶囊小剂量组、参参康心胶囊中剂量组、参参康心胶囊大剂量组共六组，每组10只。参参康心胶囊低剂量组(1.5g生药/kg)、中剂量组(3g生药/kg)、大剂量组 (6g生药/kg)用参参康心胶囊溶液分别按0.25ml/次、0.5ml/次、1ml/次灌胃；阳性对照组按成人常规剂量折算后给药即（0.076g/kg），1ml/次灌胃；空白对照组与模型组每日给予1ml生理盐水, 各组每天灌胃2次，连续一周。方法[2]，模型组、阳性对照组（地奥心血康组）、参参康心胶囊小剂量组、参参康心胶囊中剂量组、参参康心胶囊大剂量组于末次给药30min后，腹腔注射垂体后叶素（Pit）30u/kg。

    2.2  小鼠心肌细胞线粒体的分离、提取

    参考文献方法[3]，注射Pit15min后，将小鼠处死，立即摘取心脏，在冰冷的（4℃）磷酸缓冲液中洗去血液，滤纸拭干，称重； 取心脏用眼科小剪刀尽快剪碎，倒入玻璃匀浆管中，加入9倍于心脏重的冰冷匀浆介质，将玻璃匀浆管插入盛有冰水混合物的容器中匀浆； 将制备好的匀浆移入2ml离心管，用低温低速离心机以2000r/min离心10分钟，弃沉淀； 取上清液用低温高速离心机以10000r/min，4℃条件下离心15分钟，弃上清，沉淀物即为线粒体。将分离的线粒体用20倍的冰冷匀浆介质制备成混悬液，在0～4℃储存待测。

    2.3  参参康心胶囊对垂体后叶素模型小鼠心肌细胞线粒体超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）含量的影响

    取各组线粒体混悬液，采用硫代巴比妥酸法[３]，按照南京建成生物工程研究所MDA测定试剂盒说明书的步骤进行测定。

    2.4  统计学方法

    将所测结果按试剂盒说明书，采用SPSS13.0软件统计，用t检验。计量资料，以均数±标准差(ｘ±ｓ)表示。

    3  结果

    3.1  参参康心胶囊对垂体后叶素模型小鼠心肌细胞线粒体超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

    结果见表1。从表中可见，垂体后叶素所致心肌缺血模型组SOD活力与空白对照组比较无明显变化，而参参康心胶囊大剂量组与模型组比较，SOD活性明显增强，p<0.01。参参康心胶囊的其它两组与模型组比较SOD活力有一定的增强，但无统计学意义。表1  参参康心胶囊对Pit模型小鼠心肌细胞线粒体SOD活性的影响（略）注：与模型组比较*P＜0.01。

    3.2  参参康心胶囊对垂体后叶素模型小鼠心肌细胞线粒体丙二醛（MDA）含量的影响

    结果见表2。从表中可见，模型组与空白对照组相比（p<0.01），即说明用垂体后叶素腹腔注射复制心肌缺血模型成功；阳性对照组与模型组比较（p<0.01），与参参康心胶囊组比较无统计学意义；参参康心胶囊大、中、小三剂量组与模型组比较MDA含量明显下降有显著性差异，表明参参康心胶囊对心肌缺血有明显防治作用，但参参康心胶囊三剂量组间无显著性差异。 表2  参参康心胶囊对Pit模型小鼠线粒体MDA含量的影响（略）注：与空白对照组相比#P＜0.01，与模型组比较*P＜0.01，与模型组比较**P＜0.05。

    4  讨论

    心肌缺血、缺氧多见于冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病），主要由冠脉分支部分或完全阻塞引起，属于祖国医学“胸痹”、“心痛”范畴。中医认为其病位在心，与脾(胃)、肾、肝(胆)等多脏腑相关，呈现本虚标实的病理特征。本虚责之于气、血、阴、阳，标实主要涉及气滞、血瘀、痰饮、寒凝、火热等病理产物或因素。本虚又以心气不足最为突出，标实则以心络瘀阻为主。心主血脉，气为血帅、血为气母，心气虚则无力推动血液运行，以致血行缓慢、终成瘀血。气行则水行，气滞则津停，水液代谢发生障碍而成痰饮，痰饮阻滞心脉，又会加重瘀血的病理变化，所以心络瘀阻的病机贯穿于整个病程的始终，冠心病的每个证型或多或少均有血瘀的表现。故气虚血瘀是冠心病的主要发病机制。大量临床资料也表明，益气养心，活血通络是防治冠心病的基本治法。

    参参康心胶囊是基于中医学对心肌缺血性疾病的上述认识，以名老中医的临床有效验方为基础，研制成的纯中药制剂，功能益气养心活血通络。该方临床应用多年，对冠心病、心肌梗死等心肌缺血性疾病有显著疗效。其组方精炼便于药物成分检测和质量控制。

    心肌缺血可致心肌功能紊乱，伴有严重的心肌细胞损伤，其损伤机制一直是心血管领域的重要研究课题。线粒体是一种膜性细胞器，其重要的生物学功能是氧化代谢和钙代谢。近年来随着心肌缺血损伤机制的深入研究，发现自由基的产生及脂质过氧化物反应增强与心肌缺血损伤的病理改变关系密切。心肌缺血时，自由基的生产增多，而自由基清除酶的活性降低，导致体内大量自由基堆积，进而使生物膜产生脂质过氧化反应，导致细胞膜的结构和功能损伤，从而加剧缺血心肌的组织损失及功能障碍[4、5]。本研究结果表明：腹腔注射垂体后叶素后线粒体MDA含量明显增高（p<0.01），参参康心胶囊大、中、小三剂量组线粒体MDA含量均明显下降，并且有显著性差异。从本实验结果看，腹腔注射垂体后叶素后模型组心肌细胞线粒体SOD活力略有增高，这可能是由于注射垂体后叶素后的机体发生的应激性反应而造成的，而参参康心胶囊组SOD活力虽有所增高，但无统计学意义。因此，参参康心胶囊通过清除MDA，可防止氧自由基对心肌线粒体的破坏，达到对心肌损伤的保护作用，其作用途径可能不在于提高SOD活性，可能作用于其他途径，有待进一步研究。

【】
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