HPLC法测定跳骨胶囊中士的宁的含量

        作者：姚家元 孟祥军 吕 洁 邹春阳 王凤秋  

【摘要】  目的：测定跳骨胶囊中士的宁的含量。方法：采用HPLC法，以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱：Diamonsil C18（250×4.6mm，5μm）；流动相：0.03mol/L；甲酸溶液（用三乙胺调节PH至3.0±0.1）-乙腈（78︰22）；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm。结果：士的宁在196.8～426.4ng范围内，浓度与峰面积线性关系良好（r=0.9984）。平均回收率为99.70%，RSD为2.2%（n=9），方法的精密度、稳定性及重现性良好。结论：本试验所建立的定量分析方法简便、快速准确，可作为跳骨胶囊的质控标准。

【关键词】  跳骨胶囊 士的宁 高效液相色谱法（HPLC）

    　　【Abasract】 Objective: To determination the content of Strychnine in Tiaogu Capsules by HPLC. Methods：HPLC with Diamonsil C18（250×4.6mm，5μm）column was used. 0.03mol/Lformic acid（triethylamineo adjust pH 3.0±0.1）-acetonitrile（78∶22） as a mobile phase, flow rate was 1.0ml/min and detection wavelength at 278nm. Results: The method had good linear realationship with in the rage of 196.8～426.4ng of Strychnine, the correlation coefficient(r) was 0.9984. The average recovery rate was 99.70%，RSD was 2.2%(n=9). The method is suitable for the formulate of the quality standard with sufficient accuracy、stability and reappearance. Conclusion: The method is simpie、fast and accurate. It can be used for quality control of Tiaogu Capsules.

    　　【Key words】Tiaogu Capsules；Strychnine；HPLC

 　　跳骨胶囊是由骨碎补、煅铜、土鳖虫、红花、三七、血竭、黄芪、马钱子、细辛等20味中药组成的复方制剂，具有筋伤骨痛、骨折脱位、骨质增生、风湿骨痛等疾患，本品疗效确切。国家药品标准中含量测定项采用薄层色谱扫描法测定马钱子中的士的宁[1]。马钱子的活性成分士的宁为剧毒物质，为了更有效的控制其含量，提高产品质量，我们相关[2～5]采用通用的HPLC法测定其含量，方法简便、准确、专属性强，现报道如下。

    1  仪器、试剂与样品

    　　高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）；天平（AUY-120岛津-上海公司）；色谱柱：Diamonsil C18柱（250×4.6mm，5μm），流速：1ml/min。甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。士的宁（供含量测定用，110705-200306），药品生物制品检定所。跳骨胶囊样品由山东绿因制药有限公司提供，批号20050306。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件与流动相  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；用0.03mol/L甲酸溶液（用三乙胺调节PH至3.0±1.0）-乙腈（78︰22）为流动相：检测波长为254nm；流速1.0 ml/min.理论板数按士的宁峰应不低于4000。

    2.2  检测波长的确定  取士的宁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，摇匀，照紫外分光光度法（中国药典2005年版一部附录V A），在190～400nm处扫描，溶液在254nm波长处有最大吸收，初步确定检测波长为254nm。

    2.3  士的宁含量测定线性关系试验

    　　照高效液相色谱法（中国药典2005年版一部附录Ⅵ B）试验。取士的宁对照品0.0164g，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取6、8、10、11、13ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密量取20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，结果见表6。以峰面积（Y）对进样量（X，μg）进行线性回归，回归方程为Y=0.7092X－0.914，相关系数r=0.9984。结果见表1。表1    士的宁线性关系试验结果结果表明，士的宁进样量在196.8～426.4ng范围内，峰面积与士的宁进样量线性关系良好。

    2.4  溶液稳定性试验

    　　照系统适用性试验项下制备供试品溶液，每隔2小时进样测定一次，共测定8小时，计算含量，结果见表2。表2     溶液稳定性试验结果结果表明，供试品溶液在8小时内基本稳定。

    2.5  精密度试验

    2.5.1  重复性试验  精密量取系统适用性试验项下供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，连续测定6次，结果见表3。表3    重复性试验结果结果表明，本法精密度良好。

    2.5.2  重现性试验  照系统适用性试验项下的制备方法，分别制备6份供试品溶液，分别精密量取20μl，连续测定6次，计算含量，结果见表4。表4        重现性试验结果结果表明，本法重现性良好。

    2.6  回收率试验

    　　取士的宁对照品0.0158g，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，从中精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

    　　取装量差异项下的内容物适量，研细，取约1.2g，精密称定，加浓氨试液1ml与氯仿20ml混合的溶液，加热回流1小时，放冷，抽滤，用20ml氯仿分3次洗涤滤渣及滤器，合并滤液与洗液，置分液漏斗中，用硫酸溶液（3-100）提取5次，每次15ml，合并硫酸液，加浓氨液调节PH值至9～10，用氨仿提取5次每次20ml，合并氯仿液，蒸干，残渣用15ml甲醇水溶温热溶解后，放冷，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，续滤液作为供试品溶液。

    　　精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，测定，测得供试品中士的宁的含量（C）为210.6μg/g。

    　　取士的宁对照品0.0153g，置100ml量瓶中，加甲醇使溶液并稀释至刻度，摇匀，从中精密量取25ml，置250ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为加样用对照品溶液。

    　　取上述已测定含量的供试品药粉，分别精密称定约0.3g、1.2g、2.0g各三份，精密称定，加浓氨试液1ml与氯仿20ml混合的溶液，再分别精密加入15ml加样用对照品溶液，加热回流1小时，放冷，抽滤，用20ml氯仿分3次洗涤滤渣及滤器，合并滤液与洗液，置分液漏斗中，用硫酸溶液（3-100）提取5次，每次15ml，合并硫酸液，加浓氨液调节PH值至9～10，用氯仿提取5次每次20ml，合并氯仿液，蒸干，残渣用15ml甲醇水溶温热溶解后，放冷，转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，续滤液作为加样溶液。

    　　精密量取上述各溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定含量，加样回收率，测得9次平均回收率为99.7%，RSD为2.2%，结果见表5。

    　　测得量（mg）=A供/A对×C对×50（ml）

    　　样品中士的宁含量（μg）=供试品取样量×210.6（μg/g）表5               加样回收试验测定结果

    2.7  含量限度确定的试验

    　　经上述方法学验证，本系统可以准确的测定本品的含量。最后确定色谱条件及测定方法如下：

    　　照高效液相色谱法（附录Ⅵ D）测定。

    2.7.1  色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：用0.03mol/L甲酸溶液（用三乙胺调节PH至3.0±0.1）-乙腈（78︰22）为流动相；检测波长为254nm；流速1.0ml/min。理论板数按士的宁峰计算应不低于4000。

    2.7.2  对照品溶液的制备  取士的宁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含16μg的溶液，作为对照品溶液。

    2.7.3  供试品溶液的制备  取装量差异项下的本品内容物，研细，取约1.2g，精密称定，加浓氨试液1ml与氨仿20ml混合的溶液，加热回流1小时，放冷，滤过，用20ml氯仿分3次洗涤滤渣及滤器，合并滤液与洗液，置分液漏斗中，用硫酸溶液（3→100）提取5次，每次15ml，合并硫酸液，加浓氨液调节PH值至9～10，用氯仿提取5次每次20ml，合并氯仿液，蒸干，残渣用15ml甲醇水溶温热溶解后，放冷，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，续滤液作为供试品溶液。

    2.7.4  测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。测定结果见表6。表6          含量测定结果依据测定结果，我们将其含量限度制定为：每粒胶囊含士的宁（C21H22N2O2）应为55～75μg。典型的标准品与样品HPLC图谱见图1和图2。

   3  讨论

    　　对于士的宁的提取，将浓氨试液与氯仿分别进行加热回流，由于浓氨试液在提取液内分散不匀，实验证明提取不完全，测定结果偏低，重现性差，我们采取浓氨试液与氯仿混合后加入提取，克服了以上的不足。加热回流1小时提取进行对照试验，结果超声处理提取测定明显偏低。由于士的宁为生物碱，具有碱性特征，在流动相中酸性条件下，加入扫尾剂三乙胺，可抑制或掩蔽固定相表面的游离硅醇基的活性，使碱性药物易于出峰，且峰形好。

    　　药典2005年版一部马钱子[5]明确限定按干燥品计算，含士的宁（C21H22N2O2）应为1.2%～2.2%，而本品处方量（1000粒）中马钱子10g，通过计算每粒胶囊含士的宁（C21H22N2O2）应为120～220μg。但考虑到药材的来源和质量差异对马钱子中士的宁含量的影响及试验测定的实际结果，所以我们将其含量限度制定为：每粒胶囊含士的宁（C21H22N2O2）应为55～75μg。

【】
  [1] 部颁标准WS 3-B-3348-98跳骨片．

[2] 中药制剂分析书[M]．第五章：133．

[3] 郭素华．跳骨片质量控制方法的研究[J]．中国药学杂志，2001，36（1）：53～55．

[4] 张春成．反相高效液相色谱法测定风湿骨康片中士的宁的含量[S]．中国药品标准，2004，5（1）：35～37．

[5] 中国药典[S]．2005年版一部马钱子质量标准．