辛伐他汀对甲状旁腺素相关肽（PTHrP）诱导小鼠头盖骨骨吸收的影响
作者：黄鲁豫，胡蕴玉 ，陶惠人，毕 龙，王 军，范洪斌，费正奇
【关键词】 辛伐他汀
摘 要：［目的］探讨辛伐他汀对体内破骨细胞功能及对局部骨吸收的影响。［方法］采用甲状旁腺素相关肽（parathyroid hormone related peptide,PTHrP）诱导的小鼠头盖骨骨吸收的动物模型体系，分别采用皮下注射辛伐他汀（0、5、10、20 mg・kg-1・d-1）的方法，检测头盖骨X线片的骨吸收面积，组织学用抗酒石炭酸染色（TRAP），检测单位面积破骨细胞的数量。［结果］辛伐他汀在皮下注射（10、20 mg・kg-1・d-1）均可抑制头盖骨的骨吸收和破骨细胞的形成，皮下注射（0、5 mg・kg-1・d-1）则无明显的抑制作用。［结论］辛伐他汀对小鼠局部骨吸收有着明显的抑制作用，对局部骨吸收的有着重要的意义。
关键词：辛伐他汀; 甲状旁腺素相关肽； 骨吸收； 动物模型
Abstract：［Objective］To investigate the effect of simvastatin on the osteoclast and the focal resorptin of calvaria bone［Method］Animal model of calvaria bone resorption was induced by parathyroid hormonerelated peptide in mice［Result］Simvastatin on the dose of 10,20 mg/kg/d could inhibit the resorption of calvaria bone and the formation of osteoclast,while,no significant inhibition was observed on the low dose(0,5 mg/kd/d)［Conclusion］Simvastation can effectively inhibit the resorption of focal bone in miceIt may provide an important strategy in treatment of diseases involved focal bone resorption
Key words：Simvastatin; Parathyroid hormonerelated petide(PTHrP); Bone resorption; Animal model
他汀类药由于抑制了胆固醇代谢中甲羟戊酸途径的羟甲基戊二酰辅酶A(3HydroxyMethylglutary 1Coenzyme A，HMG CoA)还原酶活性，具有明显的降血脂作用，目前是一种广泛应用于临床的降脂药。1999年Mundy等〔1〕在筛选了3万多种化合物后发现，他汀类药是唯一能促进成骨细胞BMP2荧光报告基因活性的物质。进一步的研究表明他汀类药可促进成骨细胞系MC3T3E1及大鼠骨髓细胞的碱性磷酸酶活性和骨质的矿化〔2、4〕，并且可促进骨质疏松大鼠新骨的形成。在正常生理条件下骨吸收与骨形成处于动态的平衡状态中，一旦这种平衡被打破将可能会导致骨质疏松的发生。破骨细胞是骨吸收的功能细胞，其吸收功能的亢进与活跃在骨质疏松中具有重要的意义。尽管以往有研究表明，他汀类药可通过促进成骨细胞BMP2基因的表达来促进骨生成，但其对正常成熟破骨细胞的骨吸收功能影响的报道甚少。本研究采用甲状旁腺素相关肽（PTHrP）诱导的小鼠头盖骨有吸收的动物模型体系，探讨辛伐他汀对体内破骨细胞骨吸收功能的作用及对局部骨吸收的影响。为阐明他汀类药物对局部骨质疏松的防治作用提供新的理论依据。
1 材料与方法
11 材 料
雄性4周龄BALB/C小鼠（购自第四军医大学试验动物中心；清洁级二级），重组人PTHrP蛋白（美国GIBCO公司），辛伐他汀原料药（simvastatin）(山东鲁南制药集团提供，生产批号：050502)。
12 方 法
121 动物模型实验
按甲状旁腺素相关肽（PTHrP）诱导小鼠头盖骨骨吸收的动物模型体系〔5〕，用Hamilton注射器，于小鼠头颅顶部左侧，每天注射PTHrP 2次，共注射5 d，每次注射10 μg/10 μl，将小鼠共分为5组（每组7只）：Ⅰ组（治疗对照组），于注射PTHrP前2 d开始皮下注射1%DMSO/生理盐水50 μl；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组（PTHrP+Simvastatin），分别于注射PTHrP前2 d开始皮下注射（5、10、20）mg・kg-1・d-1的1%DMSO/生理盐水50 μl，每天1次，共注射7 d；Ⅴ组（空白对照组），皮下注射蒸馏水10 μl，每天2次，共注射5 d。24 h处死，取材。
小鼠处死后，采集颅骨标本，使用Faxitron X线拍摄系统（型号43855，美国）拍摄X线片。用10%中性福尔马林固定3 d，脱钙48 h后，将颅骨前部沿冠状缝，后部沿人字缝切除，中间部分切成2~3 mm宽的小条，石蜡包埋，组织切片。切片作抗酒石酸染色后，再做HE染色。
122 骨吸收的定量分析
X线片用数码照相机翻拍后，保存为JPG彩色格式，使用Leica QWin 23图像分析软件分析颅骨冠状缝到人字缝之间骨吸收面积，阈值通过选取5个典型骨吸收部位的色彩强度来确定。
123 单位面积骨组织内破骨细胞数目
每个标本取3张切片，做抗酒石炭酸染色（TRAP）后，再做HE染色。靠近骨组织且抗酒石炭酸染色阳性的巨核细胞为破骨细胞。在Leico LA(德国)全自动显微镜和Pixaev数码采集系统组成的图像分析仪系统下采集图像，分析自颅骨中缝向左侧肌肉附着处（注射PTHrP的一侧）6个05mm×05 mm区域内破骨细胞数目和骨面积，单位面积骨组织内破骨细胞数目（图1） 图1X线片种骨吸收的定量方法：使用Leica QWin 23图像分析软件，选用5个典型的骨吸收部位，测量其色彩强度后作为阈值，可以将骨吸收部位挑选出来，然后通过Leica QWin 23软件自动计算人字缝和冠状缝之间的骨吸收面积124 统计学分析
SPSS 10软件系统行统计学分析，方法采用t检验。
2 结 果
骨吸收X线片下定量分析
Ⅰ组（对照组），皮下注射PTHrP 2次/d，共注射5 d，每次注射10 μg/10μl，可形成明显的露骨的骨吸收X线征象，Ⅴ组空白对照组则无颅骨的骨吸收征象；Ⅲ、Ⅳ组（PTHrP+Simvastatin）分别于皮下注射PTHrP前2 d开始皮下注射（10、20）mg・kg-1・d-1的1%DMSO生理盐水50 μl，每天1次，共注射7 d，其骨吸收面积及单位面积破骨细胞数目和Ⅰ组（治疗对照组）相比均明显减少；Ⅱ组于皮下注射PTHrP前2 d开始皮下注射5 mg・kg-1・d-1的1%DMSO生理盐水50 μl，每天1次，其骨吸收面积及单位面积破骨细胞数目和Ⅰ组（治疗对照组）相比则无明显减少（图2、3，表1）。表1 注射PTHrp和Simvastatin后骨吸收面积与单位面积内破骨细胞数目
3 讨 论
31 骨吸收性细胞因子诱导的局部骨吸收动物模型最初由Boyce BF等〔6〕人报告，Boyce在小鼠颅骨注射IL1，3 d后颅骨有明显的骨吸收，但11 d后，骨吸收部位又逐渐被新生的编织骨所填充。陶惠人〔5〕等注射PTHrP于小鼠颅骨，5 d后，产生明显的骨吸收，并且较为稳定，易于重复，是作者进行骨质疏松研究的良好的动物模型。
32 自1999年发现辛伐他汀的骨促进作用以来，大量的研究主要集中在对成骨细胞作用机制的研究，而辛伐他汀抑制破骨细胞骨吸收功能的作用目前报道甚少，尤其是辛伐他汀对体内破骨细胞的作用目前尚未见报道。最近刘波等〔7〕人报告了利用体外培养的方法，辛伐他汀体外可明显抑制大鼠颅骨破骨细胞骨吸收陷窝的形成以及培养上清钙的释放。Grasser WA〔8〕等研究表明洛伐他汀对体外培养新生大鼠破骨细胞的形成和分化有着明显的抑制作用，通过对甲二羟戊酸在破骨细胞发育代谢中作用的研究证实龙牛儿基龙牛儿醇在破骨细胞的形成和分化中起着重要作用。洛伐他汀对破骨细胞的抑制作用是通过关键异戊烯化蛋白的二牛龙牛儿基丙酮完成的，并且他汀类药物骨效应是影响局部破骨细胞数量的重要因素。大量研究发现〔9、10〕，IL6的抑制物MadindolineA(MDLA)与gp130（为IL6的功能性受体之一）结合后，IL6的活性受到抑制，破骨细胞的生成及去卵巢大鼠的骨丢失也显著被抑制，从而证明IL6在骨质疏松症发病中的作用。辛伐他汀可降低外周血单核细胞IL6的表达水平。尤其是在用药的6周以后血中IL6的浓度显著降低。但是辛伐他汀对破骨细胞的具体作用机制还有待于进一步研究。Von knoch F等〔11〕人在2005年1月报告了大鼠口服120 mg・kg-1・d-1洛伐他汀可以抑制超高分子量的聚乙烯（UHMWPE）颗粒诱导的大鼠颅骨的骨吸收，并使局部破骨细胞数目减少。
图2辛伐他汀治疗小鼠颅骨骨吸收X线片：A对照组;B、C、D为不同剂量（5、10、20 mg・kg-1・d-1 scinjection）治疗后的X线片 图3aPTHrP诱导的骨吸收;b经图像处理软件系统处理后，可自动出骨面积、破骨细胞数目及单位面积骨组织内的破骨细胞数目（Oc,N/TBA）33 他汀类药物抗骨质疏松有很大潜能，是目前发现的唯一能够既促进骨形成，又抑制骨吸收的药物，它通过很多途径、多个环节来发挥抗骨质疏松的作用。本研究采用注射PTHrP诱导小鼠颅骨局部骨吸收模型体系，研究辛伐他汀对局部骨吸收的作用表明，辛伐他汀局部注射对局部骨吸收有着明显的抑制作用，并存在着药物的剂量依赖效应。通过对局部破骨细胞数目的观察，发现辛伐他汀对局部骨吸收的抑制作用，是和抑制局部破骨细胞的形成和分化有关的。他汀类药物可以全身应用有对骨质疏松的防治作用，本研究为局部骨吸收疾病如内固定松动、关节假体的松动等的预防和治疗提供了局部治疗的理论基础。
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