组织工程骨软骨复合体的研究进展及展望
作者：杨强，彭江 综述 卢世璧，袁玫
【关键词】 软骨
随着材料、细胞生物学、力学生物学以及生物反应器技术的进步，采用组织工程的方法构建合适形状和大小的组织工程骨软骨复合体为骨软骨复合缺损的修复提供了新的希望。本文将对这一领域进行综述。
1 支 架
目前关于组织工程骨软骨体支架材料的设计原则有很大差异，主要分为以下4类：
1.1 仅采用骨支架，软骨部分不采用支架
即直接将高密度的软骨细胞或成软骨细胞直接种植到骨支架上方，在体外培养或者植入体内修复骨软骨复合缺损。Wang［1］等将高密度的猪原代软骨细胞分别种植到3种支架材料P(L)LA、P(D，L)LA、胶原／羟基磷灰石(Col-HA)复合支架材料上，在体外用闭合的静态生物反应器培养7周后，构建出的骨软骨复合体的软骨部分富含Ⅱ型胶原和糖胺多糖(GAG)，软骨部分与骨支架材料结合良好。Waldman［2］等同样将牛软骨细胞高密度种植到聚磷酸钙(calcium polypho sphate，CPP)支架上，体外成功培养出骨软骨复合体。Kandel［3］等用相同方法构建组织工程骨软骨复合体，体外培养8周以后植入到羊股骨髁间窝远端的骨软骨缺损，组织工程骨软骨复合体与周围的骨软骨床愈合良好，并且其生物力学性能有了很大的提高。
TULI［4］采用人骨髓来源的间充质祖细胞，诱导成软骨后在离心管中做成高密度的细胞片，然后将PLA支架压于其上，然后将诱导成骨的细胞种植到PLA支架中，组织学结果表明生成了软骨样组织和骨样组织，骨、软骨结合部界面跟正常骨、软骨结合部类似。
1.2 骨与软骨部分分别采用适合骨、软骨构建的不同的支架材料，然后在体外培养或者手术植入时组装成一体化双层支架
分别培养组织工程骨、软骨，然后用粘合剂粘合、缝合或者顺序植入等方法将组织工程骨、软骨部分组装成组织工程骨软骨复合体。Kreklau［5］等报道将软骨细胞／纤维蛋白悬液滴加到聚乙交酯(PGA)和左旋聚丙交酯(PLLA)共聚物支架，置于天然珊瑚(Biocoral)或人工合成的碳酸钙材料(Calcite)上，并用纤维蛋白胶和凝血酶粘合固定，用灌注式生物反应器体外培养成双层骨软骨复合物，组织学检查见软骨部分有基质分泌，骨、软骨界面结合良好。GAO［6］等利用鼠骨髓来源的间充质干细胞分别向成骨与成软骨诱导分化以后分别种植到多孔陶瓷材料和透明质烷衍生物(HYAFF-11)材料，两者之间的界面用纤维蛋白粘合，植入裸鼠皮下培养，生成组织工程骨软骨复合体，但是生成的软骨组织为纤维软骨。
Schaefer［7］等将牛的软骨细胞接种到PGA非编织纤维网状支架，将骨膜成骨细胞接种到聚丙交酯聚乙交酯共聚物(PLGA)和聚乙二醇(PEG)的混合物支架，分别培养组织工程骨、软骨，然后用缝线缝合的方法成功构建组织工程骨软骨复合体。李旭升［8］等也采用无创伤线缝合的方法组装分别培养的组织工程骨、软骨部分，构建出骨软骨复合体，但是构建的骨、软骨部分之间有大量纤维组织，没有解决骨软骨构件间分层的问题。Schaefer［9］等用将兔异体软骨细胞种植在PGA支架上，体外培养4～6周以后，与Collagraft(一种骨替代材料，含HA)缝合后构建成骨软骨复合组织，成功修复了兔股骨髁间窝(非负重区)骨软骨缺损，但是组织工程软骨部分与周围宿主软骨整合欠佳。
GAO［10］等采用顺序植入可注射钙磷复合物以及透明质烷(UA)海棉的方法修复了兔膝关节负重区骨软骨缺损。ShaomI等将骨髓来源的间充质干细胞(BMSC)分别种植到三维多孔的聚己酸内酯(PCL)支架以及磷酸三钙加强的聚己酸内酯(TCP、PCL)支架上，顺序植入兔股骨髁负重区骨软骨缺损，组织学结果显示成功的修复了骨软骨缺损，生物力学评估表明6个月时组织：工程软骨的杨氏模量接近正常软骨的水平。
1.3 骨软骨部分采用相同的支架材料构建的单层支架
Cao［12］等利用熔融沉积技术(FDM)用多孔聚已酸内酯(PCL)材料制造出多孔蜂窝状 的支架材料，分为两部分，分别种植成骨诱导的入骨髓基质细胞和人肋软骨细胞，扫描电镜结果表明骨、软骨部分有不同的基质分泌。Alhadlaq［13～15］等将鼠骨髓基质干细胞分别向成软骨与成骨方向诱导分化，然后用聚乙二醇(PEG)水凝胶悬液包裹，顺序倒入具有人颞下颌关节突形状的模具中，在裸鼠皮下成功培养4周后组织学观察到分层的软骨样和骨样组织。
1.4 骨软骨部分采用不同的支架材料构建的一体化的双层支架
直接构建骨软骨部分结合良好的一体化双层支架，这种支架的优点是：(1)骨、软骨支架部分结构不同，分别适合骨、软骨生长的不同要求；(2)骨、软骨部分结合良好，解决了在体外培养或者植入体内时骨、软骨分层的问题。这种一体化的组织工程骨软骨复合支架，可能是以后的方向。
Chang CH［16］利用明胶和煅烧骨制备了骨、软骨支架部分结合良好的新型骨软骨双层支架，作为软骨组织支架的明胶部分渗透到作为骨支架的煅烧骨中，达到良好的结合。将猪软骨细胞接种到明胶支架部分，放在特别设计的双腔生物反应器中培养2周或者4周，组织学检查表明骨软骨复合体的软骨部分为透明软骨病且有陷窝形成。Hung CT［17～19］等用松质骨和包裹软骨细胞的琼脂糖凝胶体外培养构建出骨软骨复合体。Tanaka［20］等用胶原凝胶覆盖在多孔的D-TCP构建双层支架，在胶原凝胶中种植软骨细胞部分修复了兔关节骨软骨缺损。这几项研究的共同点就是采用凝胶作为软骨支架，利用凝胶能渗入到多孔骨支架材料的特性，构建出的骨软骨复合组织不易分层，构建出结合良好的组织工程骨软骨复合体。
Sherwood［21］等利用三维打印技术(TheriForm TM)制造出的新型骨—软骨三维支架，体外成功培养出组织工程骨软骨复合物。支架的软骨部分采用D，L?PLGA／L?PLA材料，孔隙率为90％，孔径为106～150 μm；骨部分采用L?PLGA／TCP材料，孔隙率为55％，孔径为125～150 μm。特别新颖的是在骨、软骨支架交界区组成成分含量、气孔率等方面形成梯度变化，这样可以避免支架在体外培养和体内植入时发生界面分层，有利于新生的骨与软骨组织之间形成良好界面；并且骨支架部分设计成苜蓿叶形状，体内植入时增加了支架材料与周围骨质的接触面积，增强了抗扭转应力。解放军总骨科研究所张东［22］等将兔骨髓基质细胞成软骨诱导以后种植在一体化不同孔隙率的双层PLGA支架材料上构建组织工程骨软骨复合体，成功的修复兔膝关节软骨及软骨下骨缺损。
2 种子细胞
关于种子细胞的接种类型具体分为以下4类：
2.1 只接种用于软骨构建的种子细胞
在修复骨软骨缺损时，由于骨髓中含有大量的骨源性细胞，因此组织工程骨软骨复合体可以只接种用于软骨组织构建的种子细胞。Wang［1］waldman［2］Sherwood［21］等仅用软骨细胞为种子细胞在体外构建了骨软骨复合体，或用于体内骨软骨缺损的修复。但是软骨细胞本身为成熟细胞，增殖能力较低，并且存在去分化现象，分泌基质能力降低，并且在实际临床应用中存在来源有限、多次手术的问题［23］，可向软骨分化的干细胞如骨髓基质干细胞或者脂肪干细胞［24］是一种较好的选择。
2.2 骨软骨部分分别接种用于骨、软骨构建的组织细胞
Schaefer［7］等采用软骨细胞和骨膜细胞，Cao［12］等用人肋软骨细胞和人骨髓来源的间充质干细胞，Schek［25，26］等采用猪的原代软骨细胞与腺病毒转染BMP?7基因的人成纤维细胞为种子细胞在体外成功构建出骨软骨复合体。
2.3 接种可诱导成骨与软骨的干细胞
Tuli［4］等用人骨髓来源的间充质组细胞分别向软骨和骨方向诱导，成功构建出骨软骨复合体。采用单一的多能干细胞作为种子细胞辅以诱导成骨、成软骨，并在支架材料上诱导骨软骨复合组织形成的方法，虽然调控过程复杂，但是其过程类似于体内骨软骨发育过程，故可能是以后的方向。
2.4 单纯支架材料，不接种种子细胞
Fukuda［27］等利用羟基磷灰石(HA)喷涂的超高分子量聚乙烯纤维制造的三维支架，用I型胶原和FGF-2浸渍后，用于修复兔膝关节髁间窝的骨软骨缺损，48周后有透明软骨样组织和新的软骨下骨生成。可见，即使不接种细胞，在支架材料中结合生长因子也可用于骨软骨缺损的修复。
3 生物反应器技术在骨软骨复合体培养中的应用
生物反应器在组织工程中的研究主要包括：(1)在三维支架上均匀种植种子细胞；(2)促进组织工程产品的营养供应；(3)模拟体内力学环境施加一定力学刺激；(4)通过自动化和标准化控制组织工程产品的生产过程，降低生产成本，大规模生产。
Chang［16］等创新性设计了专门用于骨软骨复合物共同培养的双腔搅拌灌注式生物反应器，具有2个腔，中间用硅胶膜隔开，骨软骨复合支架放置在硅胶膜的孔中，通过磁棒的搅动和培养基的灌注增加营养供应，不同的种子细胞(如软骨细胞和成骨细胞)可以在硅胶膜隔开的骨软骨支架中以不同的培养基培养，并且可将多能干细胞接种到骨软骨支架后在生物反应器的2个腔中分别向成骨、成软骨两个方向诱导。Kreklau［5］研制的灌注式生物反应器也成功地培养出了骨软骨复合组织。
4 组织工程化全关节或半关节的构建进展
利用组织工程的方法构建大面积的组织工程化骨软骨复合体甚至一个组织工程化半关节或者全关节，也是一个重要的研究方向。
Isogai［28］等将预制成远节、中节指骨外形的PGA和PLLA共聚物用骨膜包裹构建中、远节指骨，呈关节软骨外形的PGA材料接种软骨细胞后培养形成软骨，PGA接种腱细胞培养形成关节囊，采用缝合方法将各配件组装起来形成中、远节指骨与远侧指间关节并植入裸鼠皮下，观察到具有指骨和关节结构外形的骨、软骨、关节囊形成，证明了培养人体小关节的可行性。Alhadlaq［13～15］等研制出具有颞下颌关节突形状和大小的组织工程化骨软骨复合体。Glowacki［29］和Feinberg［29］亦提出采用组织工程骨、软骨、关节盘构建复杂的颞下颌关节的设想。Schek［25,26］等利用图像辅助设计IBD(image?baseddesign)技术和SFF(solidfree?form)固态自由成型技术制造出了具有颞下颌关节(TMJ)外形的的生物仿生支架，其优点是能够根据个体化病人的损伤生产出与关节面几何形状相匹配的支架，并且能同时控制支架的微结构。Hung［18，19］等采用机辅助设计(CAD)和制造技术制造出的骨软骨复合组织，软骨面面积达11.7 cm2，平均厚度达3.4 mm，是迄今为止体外构建最大的具有关节面外形的骨软骨复合组织。
5 存在问题
尽管组织工程骨软骨复合物和组织工程化关节的研究取得了很大进展，但研究中也暴露出一些问题：(1)无论在体外或体内，构建组织的骨、软骨界面结合欠佳；(2)形成的骨与软骨组织的质量缺陷，透明软骨比例少，缺乏正常关节软骨的分层结构，部分工程化软骨缺乏表浅的扁平细胞层和潮标等；(3)构建的骨软骨复合组织的软骨部分面积受限，机械性能较差，还不能满足承重的要求，并且能否长期持续存在尚待进一步研究证实，只是短期观察表明在形态学、生化成分等方面具有软骨组织结构；(4)组织工程软骨与周围宿主软骨整合欠佳。
6 展 望
构建功能性的组织工程骨软骨复合物对作者来说是非常大的挑战，以下几个方面将是努力的方向：(1)种子细胞，采用单一的多能干细胞作为种子细胞辅以诱导成骨、成软骨；(2)支架材料，采用第三代生物支架材料，即在控制支架的微结构的基础上，研究如何在支架材料中结合生长因子或细胞因子更好的促使细胞增殖、分化、成熟，研究如何使骨、软骨支架材料更好的结合以避免分层，研究如何采用图像辅助设计(1BD)技术和先进制造技术制造与关节缺损甚至全关节形状、大小一致的支架；(3)生物反应器技术的应用，研制适合组织工程骨软骨复合物培养的生物反应器。采用功能组织工程学(Functional tissue engineering)的方法，模拟体内生化环境和力学环境，利用生物反应器对组织工程化组织施加一定的力学刺激，以提高骨软骨复合物的生物力学性能，达到植入体内负重的要求。
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