白及胶对体外培养兔胆管成纤维细胞形态及活性的影响
【摘要】 目的 观察白及胶对成纤维细胞形态及活性的影响。方法 分离培养日本大耳白兔胆管成纤维细胞，加入不同浓度白及胶进行共同培养，在光镜下观察日本大耳白兔胆管成纤维细胞形态的改变，用MTT法比色法检测日本大耳白兔胆管成纤维细胞活性。结果 白及胶组成纤维细胞胞体较小，胞突少，多呈圆形，胞核较小。白及胶组0.1、1.0、10.0 mg/mL白及胶在作用72 h时成纤维细胞活性与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)。结论 白及胶对日本大耳白兔胆管成纤维细胞形态的影响及白及胶对日本大耳白兔胆管成纤维细胞活性的抑制作用，可能是白及胶防治日本大耳白兔腹腔粘连的机制之一。
【关键词】 成纤维细胞；白及胶；药物作用
Influence of Hyacinth bletilla decocted water on fibroblastic morphology and activity from culture rabbit biliary duct
【Abstract】Objective To observe the influence of Hyacinth bletilla decocted water on fibroblastic morphology and activity. Methods Fibroblastic cells were separated from culture rabbit biliary duct.The different concentration of Hyacinta bletilla decocted water were added and cocultured.Changes of fibroblastic morphology were observed by light microscope.Fibroblastic activity were detected by MTT colorimetric method.Results In Hyacintn bletilla group fibroblastic cell hare small soma,a little spine.There was obvious difference on fibroblastic activity between control group and Hyacintn bletilla group at 0.1,1.0,10.0 mg/mL on 72 h(P＜0.01，P＜0.05).Conclusion Hyacinth bletilla decocted water have inhibition effect on fibroblastic activity from rabbit biliary duct.
【Key Words】 Fibroblastic cell;Hyacinth bletilla;Drug effect
成纤维细胞（fibroblast，FB）在损伤的修复过程中发挥着重要作用。过度活化的成纤维细胞可导致损伤部位纤维组织增生，是粘连形成的重要因素。目前，尚缺乏有效的药物加以防治。控制FB的生物学特性和增殖功能是预防术后粘连形成的基础和关键。我们应用体外培养的兔胆管成纤维细胞，观察白及胶对成纤维细胞形态及增殖活性的影响，探讨白及胶防治术后腹腔粘连的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
日本大耳白兔1只，雄性，体质量3 kg，由天津实验动物中心津南区明禾养殖场提供，动物合格证号:07311。MCO-15A型CO2培养箱为日本SANYO生产；超净工作台为天津医药净化设备厂生产；TDL-40 B离心机为上海仪器厂生产；Anthos?2010型全自动酶标仪为奥地利生产；WZS-A微量振荡器为无锡医用器材公司生产；COIC型倒置显微镜由重庆光学仪器厂生产。
1.2 方法
1.2.1 白及胶的制备
将白及粗粉加适量蒸馏水浸泡过夜,煎煮2次，每次30 min。合并煎液,用双层纱布滤过，4 000 r/min离心15 min。除去沉淀，滤液浓缩至每mL相当于生药1 g，加95%乙醇，使醇含量达70%,搅匀，静置过夜,滤去乙醇，沉淀水浴挥净乙醇,沉淀加蒸馏水,搅匀(每mL相当于白及生药1 g),得白及胶。
1.2.2 成纤维细胞的制备［1］
日本大耳白兔禁食16 h，20%乌拉坦(1 g/kg体质量)耳缘静脉注射麻醉，无菌开腹找到胆管，近肠壁端止血钳钳夹损伤胆管1.5 cm后关腹。72 h后再次无菌手术取胆管2 cm，放入含有青霉素及链霉素的0.9%氯化钠注射液中，在净化台中无菌操作剖开胆管，反复冲洗，尽量刮除胆管黏膜层，眼科剪刀剪碎成约1 mm3的组织碎块，加入Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)营养液放入25 mL培养瓶中，瓶底倒置于CO2孵育箱中2 h，尽量使组织块与培养瓶壁粘附后补足含15%血清DMEM营养液培养细胞，营养液3日换液1次，待成纤维细胞至接近长满培养瓶底后，移除组织块用0.25%胰蛋白酶消化传代，待细胞生长旺盛时用于实验。
1.2.3 白及胶对成纤维细胞形态的影响
将生长良好的成纤维细胞制成细胞悬液，调整细胞密度，接种于含盖玻片的2块培养皿中，其中1块加白及胶为白及胶组，另1块加入等量的培养液为对照组，放入CO2孵育箱培养72 h，待细胞基本长成单层，取出盖玻片，95%乙醇固定，染色，封片，显微镜观察，照相保留结果。
1.2.4 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定不同浓度白及胶对成纤维细胞活性的影响
用0.125%胰蛋白酶消化成纤维细胞，细胞悬浮后加入50 mL离心管中；1 500 r/min 10 min离心洗细胞2次，弃上清后加入DMEM或RPMI-1640（细胞培养基）完全营养液重新悬浮细胞充分混匀。台酚兰染色，计数细胞成活率＞95%，调细胞数至1×104/mL。将1×104/mL细胞悬液充分混匀后加入96孔板中。96孔板每孔0.15 mL。分别将10.0、1.0、0.1 mg/mL浓度的白及胶加入96孔板，做6个平行孔。放入5% CO2孵育箱中培养分别于24、48、72 h测定细胞活性。培养结束前4 h掺入MTT（5 mg/mL）20 μL继续培养至结束，弃培养上清液加入1∶300盐酸-异丙醇溶液100 μL，微量震荡器震荡10 min，用2010型全自动酶标仪620 nm测定OD值。
1.3 统计处理
经SPSS 11.0统计软件进行方差分析，比较各组差别,以P＜0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 白及胶对成纤维细胞形态的影响
对照组细胞胞体较大，胞浆丰富，胞突多，呈多角型或梭型，胞核大，有形成细胞增殖巢趋势，见图1。白及胶处理组成纤维细胞胞体较小，胞突少，多呈圆形，胞核较小。见图2。
2.2 不同浓度白及胶对成纤维细胞活性的影响
见表1。表1 不同浓度白及胶对成纤维细胞活性的影响（略）
由表1可见，0.1、1.0、10.0 mg/mL白及胶均在作用72 h时显示出对成纤维细胞增殖具有显著的抑制作用。
3 讨 论
术后腹腔粘连形成是一个复杂的过程，涉及到生物化学及生物物理的多方面因素。多项研究表明，受损的浆膜创面和相邻腹膜的接触是粘连形成的重要因素，所以选择保护隔离创面的方法是一种行之有效的预防措施［2］。
随着细胞生物学和分子生物学的迅速，近年来有证据表明，成纤维细胞与术后腹腔粘连的形成有着密切关系。有研究证实，腹膜损伤后，其中有大量成纤维细胞被激活，激活的成纤维细胞自身可分泌大量细胞外基质，分泌多种细胞因子，其他多种炎型细胞分泌的炎症因子对成纤维细胞均有显著刺激作用，这些均与粘连的形成有密切联系［3］ 。因此，抑制成纤维细胞的增殖与活化可能是预防术后腹腔粘连的重要措施。
成纤维细胞是一种主要修复细胞，其生物学特征被认为是创伤愈合于纤维化过程中起主要作用的因素。其生物学活性包括：①参与细胞的迁移与增生；②合成多种细胞外基质（ECM），主要包括胶原、纤维黏连蛋白、弹力蛋白等；③释放胶原酶，降解细胞外基质；④分泌细胞因子调控自身增殖和合成功能，影响其他多种细胞参与愈合过程［4～6］。
中药白及为兰科多年生草本植物白及的干燥块茎，味苦、甘、涩，性微寒，归肺、肝、胃经。功效主收敛止血，消肿生肌。本研究发现，白及胶局部涂抹于损伤的浆膜表面，可以有效地减轻腹腔粘连的形成，因此推测中药白及可能对损伤局部成纤维细胞有一定的抑制作用。本研究应用体外培养的成纤维细胞，观察白及胶对其形态及增殖活性的影响，结果发现白及胶组成纤维细胞胞体较正常组小，胞突少，多呈圆形，胞核较小，而且0.1、1.0、10.0 mg/mL浓度白及胶均在作用72 h时显示出对成纤维细胞增殖具有显著的抑制作用，因此认为白及胶对成纤维细胞形态的影响及对成纤维细胞活性的明显抑制作用可能是白及胶防治腹腔粘连的机制之一。
【】
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