肾衰3号颗粒剂对阿霉素肾病大鼠氧自由基的影响
作者：孙元莹，郭茂松，迟继铭，张万祥，张琪
【摘要】 目的探讨肾衰3号颗粒剂对氧自由基的影响，推测肾衰3号缓解慢性肾功能不全（CRF）恶化的作用机理。方法将大鼠随机分为5组，正常组、模型组、低剂量实验组、高剂量实验组和洛丁新组。将大鼠尾静脉注射阿霉素7.5 mg/kg体重，造成阿霉素肾病模型。观察血肌酐（Scr）、尿素氮（Ccr）、肌酐清除率、24 h尿蛋白定量（Uprot）、血清超氧化物歧化酶（SOD）、血清丙二醛（MDA）、肾皮质谷胱苷肽过氧化物酶（GSH?PX）和肾皮质MDA、尿N?乙酰?葡萄糖苷酶（UNAG）、尿β2?微球蛋白（β2?MG）的改变，以及肾小管-间质病理变化。结果高剂量组尿蛋白含量、Scr、Bun明显降低，与模型组相比，差异显著（P＜0.01）；高剂量组肾皮质 GSH?PX的活性、血浆 SOD活性明显降低，肾皮质 MDA含量、血清 MDA明显降低，肾小管?间质病理变化，高剂量实验组明显减轻，与模型组相比，差异显著（P＜0.05）。结论 肾衰3号颗粒剂有抗脂质过氧化作用，从而间接地保护肾小球功能，延缓 CRF的进展速度。
【关键词】 慢性肾功能不全； 肾衰3号； 氧自由基； 阿霉素肾病
蛋白尿是肾脏病常见表现，越来越多研究证实，尿蛋白可作为一个独立因素参与肾功能损害，程度呈正相关［1～3］，有学者称为蛋白尿学说。正常情况下，只有低分子物质能进入肾小球囊腔，大分子蛋白质由完整的肾小球基底膜屏障将之保留于肾小球毛细血管管腔内。当患有肾小球肾炎时，基底膜屏障破坏或消失，大分子蛋白包括白蛋白和更大分子量的蛋白质便可进入系膜区以及肾小管液中，此时系膜细胞及肾小管上皮细胞，一次又一次地与这些被异常滤出的大分子蛋白接触，并且相互反应，导致肾小球以及肾小管间质的进一步损害，从而加速肾功能恶化。肾衰3号颗粒剂是导师张琪教授经验方［4］，在黑龙江省中医肾病中心被广泛用于蛋白尿，疗效满意。为进一步探讨其作用机理，进行以下实验。
1 材料和方法
1.1 材料
肾衰3号颗粒由人参、黄芪、葛根、何首乌、丹参等中药组成，黑龙江省中医研究院制剂室制备；洛丁新：北京诺华制药有限公司制造；阿霉素（ADR）：汕头特区明治医药有限公司制造，批号991101；考马斯亮蓝 G?250；原本皓生物试剂有限公司提供。SOD试剂盒、GSH?PX试剂盒、MDA试剂盒，由南京建成生物工程所提供；尿 NAG试剂盒，购自福建三强生物有限公司。
1.2 方法
纯系成年 Wistar大鼠60只，体重(280±20) g，雌雄各半，60日龄，黑龙江中医药大学动物室提供，购入后适应饲养1周，普通饮食，自由饮水，1周后开始实验。随机分为5组，Ⅰ组正常对照组；Ⅱ组模型对照组；Ⅲ组低剂量实验组；Ⅳ组高剂量实验组和Ⅴ组洛丁新对照组。除正常组外，其它各组一次性尾静脉注射0.2％阿霉素溶液，7.5 mg/kg体重，Ⅰ组注射等量生理盐水。第4周确定造模成功后，Ⅲ组Ⅳ组分别灌胃肾衰3号颗粒剂2 mg/kg体重，5 mg/kg体重，1次/d，至第18周；Ⅴ组灌胃洛丁新10 mg/kg体重，1次/d，至第18周；Ⅰ组、Ⅱ组，每日灌等量生理盐水。给药前每周用代谢笼收集一次24 h尿液，记录尿量，查尿蛋白，第18周大鼠禁食12 h称重，无菌摘眼球取血，断头处死，剖取双肾，分3部分，供光镜、电镜和免疫组化实验；鼠血离心；双肾常规石蜡包埋及 HE染色。
1.3 观察项目及测定24 h尿蛋白定量、血肌酐、血尿素氮、内生肌酐清除率用常规法测定。肾小管－间质病理变化，普通光镜观察，每张切片随机观察3个视野，采用半定量分级。（1）肾小管病变：O级 肾小管上皮细胞无明显变化；Ⅰ级 肾小管上皮细胞萎缩病变较轻，呈灶状分布；Ⅱ级 肾小管上皮细胞坏死严重，成片分布；（2）间质炎症：O级 肾间质无或极少见炎性细胞侵润；Ⅰ级肾间质少量散在炎性细胞侵润；Ⅱ级肾间质大量弥散或集聚成灶的炎性细胞侵润；（3）肾间质纤维化：0级无纤维组织增生；Ⅰ级纤维组织呈小灶性；少量分布。Ⅱ级 纤维组织呈多灶状或网连成片。
1.4 统计学处理计量资料用t检验,样本均数用±s表示,等级资料用 Ridit分析。
2 结果
2.1 各组24 h尿蛋白含量变化结果见表1。表1 各组24 h尿蛋白含量比较（略）
2.2 肾小管间质病理变化结果见表2。表2 肾小管间质病理变化（略）
各组与Ⅱ组比较 P均＜0.05；各用药组肾小管?间质病理变化比Ⅱ组明显减轻，Ⅲ组更加明显。
2.3 肾功能变化结果见表3。表3 肾功能变化 （略）
2.4 肾皮质 GSH?PX，MDA变化及血清 SOD，MDA变化结果见表4。表4 肾皮质 GSH?PX、MDA以及血清 SOD、MDA变化（略）
2.5 对尿 NAG的影响及尿 β2?MG影响结果见表5。表5 尿 NAG及尿 β2?MG影响（略）
3 讨论
近年来慢性肾功能不全（CRF）呈高发趋势，其病程不可逆，且进行性加重，使其日益成为危重症领域的重要课题［6］。中外学者都把保护残存肾单位，延缓其恶化速度作为治疗关键。而蛋白尿作为加速其恶化的一个独立因素，日益引起重视［1，4，6］。蛋白尿在中医范畴内尚无恰当命名。中医认为，人体精微物质由脾化生，由肾收藏。蛋白尿的生成，实与脾肾两藏的虚损密切相关。脾失固涩，精微下注；肾气不固，精微下泄；另外湿毒内蕴，郁而生热，亦可使肾气不固而精气外泄，长期大量蛋白尿，精微物质随小溲而去，不能滋养五脏，则脾肾虚损进一步加重；精微不能正常化生，反而酿为水湿痰浊，故或见低蛋白血症，或见高脂血症。进一步浊阴弥漫与脏腑功能损害互为因果，恶性循坏，出现氮质血症，则病情日趋严重。
医学发现，尿蛋白漏出过多，加重肾小管需血，耗氧不足的矛盾，导致肾小管变形萎缩；另一方面，尿蛋白漏出过多，肾小球压力增高，迁延日久，出现肾小球动脉硬化，使肾小球萎缩；再者由于尿蛋白长期大量丢失，血浆蛋白水平下降，肾脏组织容易发生变性，最终也会出现肾小球萎缩［7］。在阿霉素（ADR）肾病发病过程中，氧自由基（OFR）起重要作用，ADR在肾内被还原成为半醌自由基，反应生成OFR，诱发肾小球上皮细胞脂质过氧化，氧自由基生成增加，引起肾小球内皮细胞肿胀，上皮细胞足突融合等组织细胞损伤，最终导致滤过膜通透性增加引起以蛋白尿为主的系列病理变化。SOD与GSH?PX能有效地清除氧自由基，SOD、GSH-PX活性下降，OFR含量升高可能是造成 ADR肾病肾小球损伤和蛋白尿的重要因素之一。N-乙酰-β-葡萄糖胺酶（NAG）是肾小管损伤的有意义指标，其可能机制是，发生蛋白尿时，进入肾小管上皮细胞内蛋白质增加，过度蛋白引起溶酶体酶溢入肾小管细胞浆，促进炎症或疤痕形成。β2微球蛋白判断肾小球滤过功能，较血清肌酐更灵敏，部分肾小球滤过功能受损时，尿 β2-MG浓度即可升高。
肾衰3号［4］就是根据上述观点，以补脾益肾法为主，辅以活血化瘀，用于 CRF伴有大量蛋白尿者，疗效满意。以人参，黄芪为主，加入白术，葛根，四药健脾益气，升阳益胃解毒，助化源补益气血；淫阳藿，山茱萸，何首乌温补肾气；丹参行血去瘀，养血解毒。诸药相合，健脾而不燥，滋肾而不腻。药理证明，黄芪能降低自由基生成、促进自由基清除［8］；人参及其有效成分对 CRF具有预防和作用，对肾小球性蛋白尿有明显的降低作用；葛根能明显改善肾血流，抑制血小板聚集、降低血黏度；丹参中的水溶成分之一丹酚酸A能抑制成纤维细胞增殖，降低成纤维细胞胶原合成，缓解组织纤维化。既往研究证实肾衰3号能够下调血小板源生长因子（PDGF?β）、转化生长因子（TGF-β1）的表达,减轻肾间质纤维化，延缓慢性肾小球疾病进行性恶化［4,9,10］。本实验显示：肾衰3号可明显提高 SOD，GSH?PX水平，降低 MDA含量，显示该药通过激活 SOD，GSH?PX的活性，抑制自由基，降低脂质过氧化物，从而抗脂质过氧化损伤，降低蛋白尿，改善肾功能，避免肾组织结构破坏。同时能明显降低尿 NAG及尿 β2?MG水平，说明其对肾小管及肾小球的损伤有明显治疗作用，而且为纯中药制剂，无任何毒副作用，故有广泛的应用前景。
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