平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究

          作者：陈文，李丽立，张平，姜曼花，邱细敏  

【摘要】  目的为开发利用平白术的药用价值提供理论依据，分别提取分离平白术中有效成分多糖和氨基酸，并分别测定平白术多糖和氨基酸的含量。方法采用L9（34）实验因素设计实验，苯酚-硫酸法测定白术多糖的含量。以茚三酮为衍生试剂，采用柱后衍生法测定平白术中氨基酸含量。 结果平白术多糖的含量为15.3% 。平白术中至少含有17种氨基酸，总氨基酸含量为73.73 mg·g-1。结论 方法简单、有效、快速、准确、灵敏，适合于分析测定白术中多糖和氨基酸的含量。

【关键词】  平白术；多糖；氨基酸

　　Abstract:ObjectiveTo extract polysaccharide and amino acid　and determine their contents in order to offer the basis for using Atractylodes macrocephala Koidz from Pingjiang. MethodsUsing L9（34）orthogonal test，Phenol?sulfuric method was used to test polysaccharide content in Atractylodes macrocephala and to assay amino acid using method of Ninhydrin post-column derivation .ResultsThe analysis of Atractylodes macrocephala Koidz showed that the content of polysaccharide was 15.3% and there were at least 17 kinds of amino acids，the total content was 73.73 mg·g-1.ConclusionThe established method is quite suitable for identification and quantification of polysaccharide and amino acids in Atractylodes macrocephala Koidz.It is simple，effective，rapid，accurate and sensitive.

　　Key words:Atractylodes macrocephala Koidz  ；  Polysaccharide;   Amino acid

    白术是传统中药，《药典》收载的白术为菊科植物Atractylodes macrocephala Koidz的干燥根茎，白术具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎之效［1］。《中国药典》2005年版第一部记载含白术的处方有91个。近几年以来，中国对白术的需求量大增，居全国大宗常用中药材之首。由于其含有白术多糖、挥发油、氨基酸等多种有效成分而倍受药物研究工作者的关注，使白术的临床应用日趋广泛［2］，其研究也更为深入、更为多元化。然而，迄今为止，对白术中营养成分氨基酸研究甚少。为了开发利用白术的药用价值，本文对湖南平江产白术——平白术进行研究，提取平白术多糖、氨基酸，采用正交实验选择多糖显色条件，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。以茚三酮作衍生试剂，采用柱后衍生法测定氨基酸含量。

　　1  材料

　　1.1  仪器

　　UV?2150型分光广度计（日本岛津），日立L?8800全自动氨基酸自动分析仪

　　1.2  试剂无水乙醇、硫酸锌、氢氧化钡、硫酸、苯酚、茚三酮、柠檬酸。三钠、醋酸钠（均为分析纯）,平江白术（由湖南药材公司提供）、果糖标准品（市售）、氨基酸标准品（中国院亚热带农业生态研究所提供）。

　　2  方法与结果

　　2.1  显色条件的考察

　　2.1.1  苯酚浓度对显色单因素的影响吸取标准溶液1 ml于10 ml具塞试管中，精密加入1 ml不同浓度的苯酚和5 ml浓硫酸，混匀，放置5 min。移入25℃的水浴中保温20 min。冷却。以蒸馏水1 ml加相应的试剂作空白，测定吸收度。见图1，表1。表1  苯酚浓度的考察（略）

    实验结果表明,苯酚浓度在4%～7%范围内所得吸收值相近,苯酚浓度为5%时所得吸收值较大,故选择苯酚浓度为5%。

　　2.1.2  苯酚-硫酸法正交实验设计［3］实验因素水平表设计：实验选择苯酚用量（5%苯酚）、浓硫酸用量、水浴温度和水浴中的放置时间4个因素作为考察对象，根据初步实验，每个因素确定3个水平，采用L9（34）正交表进行实验（见表2）。以吸收度为评价指标（表3）。对结果进行统计学处理，得方差分析见表4。表2  实验因素水平（略）表3  L9（34）正交实验结果（略）表4  方差分析（略）

    经方差分析可知，苯酚用量、浓硫酸用量、水浴温度及水浴放置时间对吸收度影响不显著，但综合比较，本实验选择苯酚-硫酸法最佳显色条件为A3B1C3D2即苯酚1.2 ml，浓硫酸4 ml，水浴温度25℃，水浴放置时间30 min。

　　2.2  测定波长的选择精密称取一定量多糖样品置小烧杯中，加水溶解，定量转移至100 ml量瓶中，加水至刻度，混匀。吸取该样品2 ml于试管中，加5%苯酚水溶液1.2 ml混匀，迅速加入4 ml浓硫酸，振摇10 min，在25℃水浴保温放置 30 min，取出冷却，以苯酚-硫酸溶液为空白，于400～800 nm范围扫描，选择最大吸收波长488.4 nm为测定波长。

　　2.3  标准曲线精密称取105℃干燥至恒重的标准果糖18.70 mg，加水溶解至250 ml，配成74.8 μg/ml的标准储备液。取10 ml具塞试管，分别加上述标准液0.0，0.10，0.20 ，0.30，0.40 ，0.50，0.60，0.70 ml，加水稀释至1 ml，摇匀，每个试管各加5%苯酚水溶液1.2 ml混匀，再迅速加入4 ml浓硫酸，振摇10 min，在25℃水浴保温放置 30 min 。以水作空白在488.4 nm处测定各标准液的吸收度，得回归方程A=0.098 3C+0.0.092 6（r=0.999 4）。其在1～20.6 μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。

　　2.4  换算因素测定精密称取干燥的平白术多糖20 mg，用蒸馏水溶解后定容至100 ml，作为多糖储备液。精确量取多糖储备液0.2 ml，加水至1.0 ml，按测定标准曲线同样的方法测其吸光度值。按下式换算因素：f=W/CD，试中：W为多糖质量（μg），C为多糖液中果糖的浓度（μg/ml），D为多糖的稀释因素，测得f=1.24。

　　2.5  平白术多糖、氨基酸的提取

　　2.5.1  平白术多糖的提取［4］精密称取白术粗粉50 g置于1 000 ml的容量瓶中，加6倍量70%的乙醇回流2 h。过滤，取滤渣加8倍蒸馏水回流2 h，趁热过滤。在滤渣中加6倍水回流1 h，趁热过滤。再在滤渣中加3倍量水回流1 h，趁热过滤，合并3次滤液，浓缩至100 ml，加无水乙醇至乙醇浓度达85%，再用75%乙醇冲洗，离心，反复6次，去溶液取沉淀。加水溶解，用5% ZnSO4 4 ml和饱和Ba（OH）2溶液16 ml振摇，离心去蛋白，反复10次［5］。将所得溶液置于冰箱中过夜，次日取出溶解，在8 000 r/min离心15   min，反复4次。用氯仿-正丁醇（4∶1）与溶液按5∶1的比例混合搅拌15 min，离心，反复3次，得澄清液即白术多糖溶液。加水至100 ml冷藏备用。

　　2.5.2  平白术氨基酸的提取称取平白术粉末40 g（过80目）投入装有搅拌器、温度计、回流冷凝器的三颈烧瓶中，加入6 mol/L的盐酸100 ml，加热水解24 h，反应温度保持在(110±1)℃左右。滤渣用少量稀盐酸浸泡，过滤，重复两次，收集3次滤液得水解液，加热7h赶盐酸。在滤液中加入0.5 g活性碳且维持滤液在(80～90) ℃，磁力搅拌脱色30 min，重复2次，减压浓缩得到50 ml橙红色的溶液，作为储备液。于4℃的冰箱中保存。

　　2.6  平白术多糖和氨基酸含量的测定

　　2.6.1  样品多糖含量的测定平白术多糖提取液稀释至适当倍数后，精密吸取1.0 ml，按照标准曲线的方法测定吸光度，计算平白术多糖的含量。

     按下式计算多糖含量：多糖含量=CDfW×100%，式中：

    W为多糖质量（μg），C为多糖液中果糖的浓度（μg/ml），D为多糖的稀释因素，f为换算因素。测得多糖的含量为15.3%。

　　2.6.2  回收率实验在样品液中精密加入不同浓度的果糖标准液（n=5），按2.3项下操作，并适当稀释，以样品液为空白，测定吸收度，计算回收率。平均回收率为98.5%，RSD=2.1%（n=5）。结果如表5。表5  回收率实验结果（略）

　　2.6.3   稳定性实验取样品在8 h内测定吸收度，1次/h。样品在4 h内稳定，RSD=1.2% 。

　　2.6.4   平白术氨基酸的测定条件［6］

    实验条件：L-8800型全自动氨基酸分析仪，钠型阳离子交换柱（4.6 mm×60 mm），分析时间35 min，流动相柠檬酸三钠缓冲液（pH 3.2～4.9），四元梯度洗脱 ， 缓冲液流速0.4 ml/min，茚三酮流速0.35 ml/min，缓冲液泵压力8～11.5 Pa，茚三酮泵压力0.9～1.2 kPa，柱温50℃，氮气压力20 kPa。

    柱的衍生条件：反应液A：390 g茚三酮/L丙二醇甲醚，反应液B：醋酸钠/醋酸：丙二醇甲醚（60∶40）；供试品和对照品溶液进样量均为20 μl。

　　2.6.5   平白术氨基酸含量的测定按上述色谱条件，使用日立L-8800 AAA分析仪进行样品测定。分离得到的氨基酸谱图如图2～3。样品中氨基酸的含量结果见表6。表6  平白术中氨基酸含量测定结果（略）

　　3  讨论

　　3.1  本实验采用75%乙醇提取除去平白术所含单糖、低聚糖等干扰性成分后，再用水提醇沉法制得白术多糖。在采用Sevag法去蛋白至少重复6～7次，才能基本上除去蛋白，且多糖损失率也较大。本实验采用硫酸锌与饱和氢氧化钡溶液脱蛋白后，再加冷冻-Sevag法除蛋白，去蛋白比较彻底。在进行乙醇沉淀时，85%的乙醇浓度已能将多糖基本沉淀出来，增加乙醇浓度对多糖的得率影响并不显著。多糖采用真空干燥法，可避免加热干燥而出现多糖变黏稠或碳化而结块现象。

　　3.2  氨基酸是构成生物体蛋白质分子的基本单位 ，与生物的生命活动密切相关，尤其与人类健康有着紧密的关系。本分析结果表明，平白术氨基酸至少含有17种氨基酸，总含量为73.73 mg·g-1。必需氨基酸和半必需氨基酸在人体中具有重要的作用，缺一不可，否则可引起生理功能异常，导致疾病。总氨基酸中含有苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等7种人体必需氨基酸，并含胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸等4种半必需氨基酸。必需氨基酸和半必需氨基酸在总氨基酸中分别占12.7%，17.8%。在水解氨基酸时，温度应严格控制在（110±1）℃，水解24 h，才能使蛋白质完全水解。

　　3.3  本研究为白术中有效成分多糖及氨基酸的提取分析、质量评价提供了一个新的定量标准，为开发利用平江白术提供了理论依据。

【】
  　　［1］国家药典委员会.药典，Ⅰ部［S］.北京：化学出版社，2000：77.

　　［2］刘思贞，邵玉芹，祝希娴.白术药理研究进展［J］.时珍国医国药，1999，10（8）：634.

　　［3］张维杰.复合多糖生化研究技术［M］.上海：上海出版社，1987：6.

　　［4］张立，马琼，何永利，等.灵芝、香菇、黄芪、枸杞提取物中多糖的含量测定［J］.中草药，2004，35（2）：167.

　　［5］陈柳蓉，邵 青，陆 蕴.白术及炮制品的多糖含量测定［J］.中草药，1997，28（4）：214.

　　［6］杨文军，李德发，王若军，等.离子交换色谱OPA柱后衍生法测定饲料中胱氨酸和蛋氨酸的含量［J］.中国畜牧杂志，2000，36（1）：26.