邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法检测珍珠粉中的氨基酸含量
作者：陈稚， 陈波， 揭新明， 张立坚
【摘要】 目的测定珍珠粉中的氨基酸含量。方法邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生反相高效液相色谱法，采用荧光检测，梯度洗脱。结果该法在28 min之内分离出15种氨基酸。结论该法样品用量少、灵敏度高、线性范围宽、重现性好，适于分离大量样品。
【关键词】 高效液相色谱； 柱前衍生法； 氨基酸； 珍珠粉
Determination of the Contents of Amino Acids in Pearl Powder by RP-HPLC after Pre?column Derivation with O?Phthaldialdehyde (OPA)
Abstract：ObjectiveIn this paper, we determined amino acids in pearl powder. Methods A manual pre-column derivation procedure has been developed by reversed-phase HPLC with O-phthalaldehyde and fluorescence detector. Results More than 15 amino acids were separated within 28 min. Conclusion The method is sensitive, precise and shows good repeatability.
Key words：High?performance liquid chromatography； Pre?column derivation； Amino acids； Pearl powder
随着生命和生物工程的，氨基酸作为组成生物大分子的基本单元，其分析方法受到重视。20世纪70年代以后，反相高效液相色谱技术在氨基酸分析中得到广泛应用，使分离时间缩短。而荧光柱前衍生技术的采用使检测灵敏度提高了两个数量级，达到pmol级。常用的衍生方法有：DABS法（衍生剂为磺酰氯二甲胺偶氮苯?DABSYL?Cl)、DNS法(衍生剂为丹酰氯?DANSYL?Cl)、FMOC法(衍生剂为氯甲酸芴甲酯?FMDC?Cl)、PITC法(衍生剂为异硫氰酸苯酯?PITC)和OPA法(衍生剂为邻苯二甲醛?OPA)等［1，2］。前4种方法存在反应活性差、速度慢、灵敏度低、反映试剂干扰等缺点，而OPA法具有衍生步骤简单、反应速度快、剩余试剂不干扰测定等优点，其应用最为广泛［3，4］。本文用Waters Pump515双泵高效液相色谱仪，以OPA为衍生试剂，测定了珍珠粉中氨基酸的含量。该法操作简单，重现性好，适于分离大量样品。
1 仪器与试剂
1.1 仪器 Waters Pump515双泵高效液相色谱仪，Waters MasslynxTM 3.5色谱管理系统（Waters, 美国），配岛津RF?10A荧光检测器，AL204天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。
1.2 试剂 15种氨基酸混合标准溶液：含每种氨基酸1.0 mg/ml，用氨基酸标准品溶于0.1 mol/L盐酸配制。OPA衍生试剂：取500 mg OPA和10 ml甲醇, 加入100 ml 0.4 mol/L硼酸钠水液，用氢氧化钠调pH值至10，最后加入400 μl的巯基乙醇，混匀，置4℃ 冰箱中保存。
15种氨基酸标准品由疾病预防控制中心购得（中国，北京）；甲醇（色谱纯）上海陆都化学试剂厂；盐酸，氢氧化钠，硼酸钠，乙酸钠，巯基乙醇均为分析纯由上海三浦化工有限公司购得。
2 方法与结果
2.1 工作条件色谱柱：RP?C18色谱柱；流动相A为0.05 mol/L醋酸钠水液∶四氢呋喃∶甲醇=96∶2∶2（V∶V∶V）(%)；流动相B为甲醇：水=65∶35（V∶V）(%)；梯度洗脱条件（见表1）；进样前，柱子用流动相A平衡10 min。荧光检测器：发射波长 338 nm，激发波长430 nm。
2.2 衍生及分析分别取2 μl氨基酸的混合标准溶液或样品溶液和2 μl OPA衍生试剂，在注射器中来回抽取5次，混合均匀后 (定量环为20 μl) 直接注入高效液相色谱仪进行分析，以保留时间定性，峰面积外标法定量。
表1 梯度洗脱条件（略）
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线制作 在0.05～100 mg/ml浓度范围内，由6个浓度水平来绘制校正曲线。以峰面积为纵坐标，目标物相应的浓度为横坐标做校正曲线，绘制标准曲线，得回归方程。15种氨基酸峰面积和浓度之间的线性相关系数r值在0.921 5～0.999 5之间，色谱图见图1。
2.3.2 精密度试验 标准溶液连续5次进样，15种氨基酸的保留时间和峰面积的变异系数分别为0.09%～0.28%和0.8%～4.2 %。
2.3.3 重复性试验 取5份样品依法进行测定，日内、日间变异系数均＜7.5 %。
2.3.4 加样回收率试验 3个空白样品中添加低、中、高三个浓度水平的标准品完成，通过对比检测的量和实际加入的量来，结果平均回收率在85.2%～103.6 %之间。
2.4 样品测定 本实验供试样品为珍珠粉（15 g）在500 ml人工胃液溶液（10 mg/ml胃蛋白酶的水液，含1.64 % 稀盐酸，37℃±0.5℃）中的溶出样品，购自市场。表2为某一时间内NM组（纳米粉体溶出量样品）、CW组（超微粉体溶出量样品）和 CG组（常规粉 体溶出量样品）氨基酸的分析结果。珍珠粉中游离氨基酸的色谱图见图2。
表2 珍珠粉中各氨基酸的含量（略）
图1 15种氨基酸混合标准溶液的HPLC图（略）
图2 珍珠粉中氨基酸的HPLC图（略）
3 讨论
为了保持OPA的稳定性，必须每隔一天在1 ml OPA衍生剂中加2 μl巯基乙醇，来平衡巯基乙醇挥发带来的损失。
最初2 min的流速为0 ml/min 是为了保证样品与衍生剂的充分反应，本实验分别用过0.8，1.0，1.2 ml/min进行洗脱，发现流量过低，氨基酸分离差且洗脱时间长，因此确定本实验流量为1.5 ml/min，能够使氨基酸达到基线分离。
高效液相色谱荧光检测技术分析氨基酸克服了紫外检测器分析周期长的缺点，更重要的是其灵敏度比紫外检测器高，有良好的选择性，检测下限仅是紫外检测器的1/10～1/100，更适于微量分析。
实验结果所呈现的与理论规律完全符合，氨基酸的总含量CG组 < CW组< NM组，各单个氨基酸的含量不符合上述规律，这是因为供试样品在人工胃液中水解出游离氨基酸的程度不同。本实验能够简单、方便、快速、灵敏和准确可靠地测定珍珠粉中的15种氨基酸含量，且容易推广应用。因此该法适用于大批量样品的分析检测，可成为科研和生产过程中分析测定氨基酸的一种优先选择方法。
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