大蒜素对小鼠膀胱癌的体内及体外抗肿瘤效果的实验研究
【摘要】 目的了解大蒜素对小鼠膀胱肿瘤的抗肿瘤效果与机制。方法通过MTT实验评定了大蒜素的直接细胞毒活性，动物实验显示大蒜素在体内有明显的抗肿瘤效果，并用LDH释放法测细胞毒活性。结果大蒜素对膀胱肿瘤有直接细胞毒作用。大剂量组与对照组相比，肿瘤的生长速度明显受到抑制（P＜0.01），大蒜素治疗后产生了针对B16肿瘤细胞的淋巴细胞。结论大蒜素对膀胱肿瘤有明显的抗肿瘤作用。这种效果可能与直接细胞毒作用和免疫反应有关。大蒜素可能是一种有效的表浅膀胱癌腔内治疗药物。
【关键词】 大蒜素； 抗肿瘤； 膀胱肿瘤
The Experimental Research on the Antitumor Effect of Allicin on Murine Bladder
Abstract：ObjectiveTo understand anti?tumor effect and mechanism of allicin on murine bladder.MethodsThe direct inhibition effects of allicin in vitro was evaluated by MTT Assay.Anti?tumor effect of allicin in vivro was determined by animal experiment. CTL activity of lymphocyte was measured by the release of endogenous lactate dehydrogenase(LDH).Results Allicin had significant direct cytotoxicity to bladder cancer cells. In high dose group,it showed a marked delay in the appearance and growth of tumors after s.c. injection compared with control group(P＜0.01).The body generated the cytotoxic lymphocyte responses to B16 tumor cells after treated with allicin.ConclusionAllicin has a marked anti?tumor effect on bladder tumor.This effect may be related to direct cytotoxicity and immune response.It may be an effective intravesical treatment agent for superficial bladder cancer.
Key words：Allicin； Anti?tumor effect； Bladder tumor
大蒜为百合科葱属两年生草本植物，有效成分为大蒜素，在我国民间药用已有三千多年的。研究提示大蒜对肿瘤有良好的防癌、抗癌作用。有报道显示大蒜提取液对膀胱肿瘤生长有明显抑制作用，但是一些实验动物死于治疗相关的毒性［1］。
B16肿瘤细胞是美国田纳西大学（Tennessee University）M.S.Soloway利用口服N-甲酰胺（FANFT）从C3H小鼠诱发而来［2］。这种低分化移行细胞癌所表现的转移特性与人移行细胞癌相类似。为了解大蒜素对膀胱肿瘤的治疗效果和机理，我们测定了大蒜素在体外对B16肿瘤细胞生长的影响，并且评估了其在体内抗肿瘤效果和对局部免疫的影响。
1 材料与方法
1.1 动物30只6～8周龄雌性C3H/He鼠（体重g）是从北京维通利华实验技术有限公司购得。所有实验均根据广东医学院动物实验指南进行。
1.2 肿瘤细胞和大蒜素B16肿瘤细胞由日本癌症资源库（JCRB）的细胞库提供（细胞编号：IFO50041）。培养于含10%小牛血清（FBS）的DMEM（GIBCO BRL，Life Technologies,MD,USA）和37℃的5%CO2中。大蒜素是由广东万基药业有限公司生产（批准文号：国药准字H44023561，生产批号20030509，规格25 mg/支；分子式C6H10S3；分子量178.33）。
2 方法
2.1 MTT实验在96孔板中建立细胞培养。在每孔中含5×103B16肿瘤细胞，每5孔为一组。为测定大蒜素在体外对肿瘤细胞生长率的影响，将不同剂量的大蒜素（2.5 ，0.5，0.1，0.02 mg·ml-1）与B16细胞共同培养48 h。加入MTT试剂培养最后4 h。酶标仪上波长560 nm测定OD值。
2.2 动物实验为测定大蒜素对膀胱肿瘤的治疗效果，将C3H/He小鼠分成3组，每一组含10只小鼠。第1组注射生理盐水1 ml（对照组），第2组注射12.5 mg大蒜素（低剂量组），第3组则注射25 mg大蒜素（高剂量组）。所种植的肿瘤细胞均用细胞铲从培养瓶中收集，用生理盐水洗2次。并将其悬浮于生理盐水中。浓度调整为1×106细胞/ml。将肿瘤细胞种植到C3H小鼠在后侧腹皮下，剂量为0.1 ml。次日将大蒜素注射到肿瘤附近的皮下，剂量分别为12.5 mg和25 mg的大蒜素。每周两次用测量器测定肿瘤的两径，观察肿瘤的生长情况［3］。
2.3 LDH释放法测细胞毒活性C3H/He小鼠皮下注射25 mg大蒜素一次进行免疫，注射生理盐水作为阴性对照。1周后收集脾细胞。96孔培养液板中将效应脾细胞与B16靶细胞按不同比例混合（混合比例从12.5∶1到100∶1）。每组3孔。在实验前，B16靶细胞与丝裂霉素C注射液（100 μg/ml）共同培养1 h。96孔培养板在37℃ CO2培养箱中培养24 h。按LDH细胞毒试剂盒提供方法与492 nm波长下检测。见图1。
细胞毒活性（%）=100%×实验组LDH-释放LDH最大释放LDH-自然释放LDH
2.4 统计学分析将所有结果进行统计分析，分析软件为SPSS11，分析方法为通过方差分析以后的两两比较P值。
3 结果
3.1 大蒜素对肿瘤细胞的体外影响MTT实验表明，当大蒜素剂量为0.1 mg/ml时，即有中度细胞毒作用，肿瘤的抑制率可达到55.7%，剂量为2.5 mg/ml对膀胱癌细胞有显著的直接细胞毒作用（肿瘤抑制率达到98.6%）。结果见表1。
图1 LDH释放法测细胞毒活性（略）
表1 大蒜素对B16肿瘤细胞体外生长的抑制（略）
3.2 大蒜素的在体抗肿瘤效果与对照组相比，大蒜素大剂量组明显延迟了肿瘤的发生。在注射19 d后，对照组的肿瘤发生率即高达80%；而小剂量治疗组（12.5 mg）的肿瘤发生率为50%；但是大剂量治疗组（25 mg）的肿瘤发生率却仅为20%（图2）。在第19天，生理盐水对照组，小剂量治疗组和大剂量治疗组的肿瘤面积分别是（0.86±1.20），（0.73±1.06）和（0.22±0.54）。大剂量治疗组与生理盐水对照组相比，肿瘤的生长速度明显受到抑制（P＜0.01）。结果见表2。
3.3 大蒜素治疗后，产生了针对B16肿瘤细胞的细胞毒T淋巴细胞
为研究这种治疗方法是否能促进体内淋巴细胞肿瘤细胞的细胞毒活性，将C3H小鼠注射25 mg大蒜素进行免疫，注射生理盐水作阴性对照。如图2所示，大蒜素免疫后产生了针对B16肿瘤细胞的细胞毒淋巴细胞［4］，而生理盐水则无此作用。
4 讨论
大蒜素（Allium sativum）化学名为二烯丙烯丙基三硫，是大蒜的主要成分。1997年D.R.Riggs等发现老蒜提取液浓度为31.3 mg/ml时，对B16肿瘤细胞的抑制率是29.9%；当浓度为62.5 mg/ml或高于此时，老蒜提取液对膀胱癌细胞有明显直接的细胞毒活性（抑制率98%）［5］。
表2 大蒜素治疗后肿瘤的面积（略）
大剂量大蒜素与对照组比较，*P＜0.01
图2 大蒜素治疗后肿瘤发生率（略）
我们在研究中观察到大蒜素对肿瘤细胞有直接的细胞毒活性。MTT实验表明，大蒜素的浓度为20 μg/ml时即有中度直接细胞毒作用，抑制率可达到41%；当浓度为2.5 mg/ml时可见到重大的直接细胞毒活性（肿瘤抑制98.6%）。与老蒜提取液相比，大蒜素的生物学活性要强25倍。这可能是因为两者的主要成分不同，虽然它们都来源于大蒜，但是老蒜提取液的主要成分是S-烯丙基半胱氨酸。
大蒜素对肿瘤细胞直接抑制的机理目前还不清楚。大蒜素的细胞毒作用可能是通过降低活性氧类自由基水平，影响肿瘤细胞NFκB活性，使NFκB与DNA结合的活性降低，NFκB通路受到抑制，导致某些基因表达水平改变［6］；或通过降低芳香胺?N?乙酰基转移酶以及2?aminofluorene 活性，从而抑制肿瘤细胞的生长［7］。此外，大蒜素抗肿瘤的另一个重要机制是刺激免疫系统。
动物实验显示大蒜素在体内有明显的抗肿瘤效果。这种效果与剂量有关。在大剂量治疗组，无论是肿瘤发生率还是肿瘤生长速度均明显低于小剂量治疗组。
LDH释放法测细胞毒活性实验的结果也表明，注射大蒜素后，能产生针对B16肿瘤细胞的细胞毒T淋巴细胞。大蒜素刺激免疫的机制与大蒜相类似。一些研究表明大蒜能引起IL?2，TNF?α以及IFN?γ的释放，并增强噬菌作用［8］。大蒜的其他活性包括增进杀伤细胞活性以及淋巴细胞对丝裂原刺激的免疫增殖反应［9］。这些效应，特别是细胞因子释放模式，表明大蒜素激活Th1细胞免疫反应，这种反应是有效抗肿瘤免疫治疗所特有。
综上所述，大蒜素对膀胱瘤有明显的抗肿瘤效果。这种效果可能与其直接细胞毒作用和免疫反应有关。本研究说明了大蒜素对膀胱肿瘤的生物学活性，并支持这样一个观点，即大蒜素是一种有效的化学预防或化学治疗药物。大蒜素可能是一种有效的表浅膀胱癌腔内治疗药物，而且价格低廉，不良反应小，值得临床推广使用。
【】
［1］ Lamm DL ,Riggs DR.The potential application of Allium sativum (garlic) for the treatment of bladder cancer［J］.Urol Clin North Am 2000,27(2)：157.
［2］ MickeyDD,Mickey GH,Murphy WM et al.In virto characterzation of four N-［4?(5?nitro ?2?furyl)?2?thiazoly］formamide(FANFT) induced mouse bladder tumors.［J］.Urol,1982,Jun,127(6)：1233.
［3］ 上海市肿瘤研究所流行病学研究室.1998年上海市市区恶性肿瘤发病率［J］.肿瘤，2001，21（4）：312.
［4］ 王 坚，谭明天，吴 宏，等.泌尿外科恶性肿瘤住院患者的情况调查［J］.广东医学，2001，22（10）：964.
［5］ Riggs DR,DeHaven JI and Lamm DL.Allium sativum(garlic) treatment for murine transitional cell carcinoma［J］.Cancer 1997,79(10)：1987.
［6］ Dirsch VM,Gerbes AL and Vollmar AM.Ajoene,a compound of garlic ,indeces apoptosis in human promyeloleukemic cells,accompaied by generation ofreactive oxygen species and activation of nuclear factor happaB.［J］.Mol Pharmacol .1998,53(3)：402.
［7］ Lin JG,Chen GW,Su CC,et al.Effects of garlic components dially sulfide and diallyl disulfide on arylamine N-acetyltransferase activity and 2-aminofluorene-DNA adducts in human promyelocytic leukemia cells.Am［J］.Chin Med .2002,30(2～3)：315.
［8］ Dausch JG,Nixon DW.Garlic:A review of its relationship to malignant disease［J］.Prev Med 1990,19(3)：346 .
［9］ Kyo E.Suzuki A.Kakimoto M,etal.Immunomodulation and antitumor activities of age garlic extract［J］.Phyto medicine 1998,5(4)：259.
