真菌细胞壁抑制剂H6794┐A的结构鉴定和抗菌活性的研究

         作者：叶丽娟 朱辉 田敏 黄晓莉

【摘要】  　　 链霉菌H6794的发酵产物对真菌细胞壁合成具有抑制作用，采用活性追踪的方法分离到活性化合物H6794-A。通过化学及波谱学分析确定为由7个氨基酸和1个长支链酰胺内酯构成的环脂肽，与neopeptin B同质。H6794-A对番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌和黄瓜枯萎病菌有明显的抑制作用。

【关键词】  真菌细胞壁　抗菌活性

　　Structure elucidation and activity of compound H6794┐A，a fungal cell wall inhibitor

    ABSTRACT Compound H6794-A，which possessed inhibitory activity against fungal cell wall synthesis，was isolated from culture broth of Streptomyces sp.H6794.The antifungal compound was elucidated to be structrally identical to a cyclic lipopeptide——neopeptin B by chemical and spectral analysis.Results showed that H6794-A could inhibit growth of Fusarium graminearum，Fusarium oxgsporum and Botrytis cinerea.KEY WORDS Antifungal compound; Fungal cell wall inhibitor; Neopeptin B

 
    真菌病害是影响农作物产量的主要原因之一，每年植物因病害造成的减产达15%［1］ 。化学农药对植物病害的防治扮演了重要的角色，但随着人们对化学农药的毒性及残留问题的日益重视，开发高效低毒的生物农药已成为亟待解决的问题。由于哺乳动物细胞中没有细胞壁，真菌细胞壁抑制剂对人体的影响相对较小 ［2］ 。在筛选真菌细胞壁抑制剂的过程中得到一株链霉菌H6794。为确定其抗真菌活性成分，以粗糙脉胞霉原生质体为模型，采用活性追踪的方法分离到H6794-A。本文报道该活性产物的分离纯化、结构鉴定及活性研究。

    1 材料与方法

    1.1 菌株分离与培养

    （1）产生菌 从西藏自治区曲积县的土壤中分离获得，编号H6794。

    （2）培养基 斜面培养基:ISP3;种子培养基（%）:可溶性淀粉2.5，葡萄糖1，酵母粉0.5，黄豆粉0.5，CaCO3 0.2;发酵培养基（%）:燕麦2，葡萄糖1，糊精2.5，蛋白胨1，酵母粉0.5，KH2 PO4 0.05，CaCO 3 0.2，pH7.0。从28℃培养7d的ISP3斜面上取适量菌体，接种于种子培养基中，28℃220r/min培养2d;将该种子培养液按10%接种量接种于发酵培养基，28℃220r/min培养6d。

　　 1.2 活性测试

    采用改良的Selitrennikoff方法［3］ ，结合倒置显微镜观察原生质体的再生情况。

　　 1.3 活性产物的分离纯化

    发酵液经大孔吸附树脂柱，正丁醇萃取，菌丝用丙酮浸提后浓缩，正丁醇萃取。合并正丁醇萃取液，浓缩，硅胶柱层析分离，得到黄褐色粉末。进一步以制备液相色谱分离。制备柱:Hypersil C

    18 （10.0mm×150mm，5μm），流动相:45%乙腈∶水（0.015%甲酸）;流速5ml/min;检测波长210nm。收集H6794-A组分，蒸干得纯品。

    1.4 结构鉴定

    （1）谱学方法

    仪器 EPI QSTAR质谱仪;NICOLET200SXV FT-IR红外光谱仪;Bruker Avance600核磁共振仪。5mg H6794-A溶于0.5ml DMSO中，由Varian Unity INOVA-400仪记录氢信号;重水交换溶剂为CD 3 COCD 3 和D 2 O;50mg H6794-A溶于0.5ml DMSO中，记录 13 C-NMR、DEPT、HMQC和HMBC图谱。

    （2）化学方法

    酸水解 称取一定量H6794-A，加入6mol/L HCl，酒精喷灯封口，110℃烘箱中水解2h。采用改良的Merfey方法 ［4］ 将酸水解产物转化成FDLA衍生物，并通过LC/MS（Agilent1100）鉴定构成H6794-A的氨基酸组成。

    碱水解 由于环状化合物在质谱仪中不容易打出碎片，因而对H6794-A进行开环处理。5mg H6794-A溶于5ml0.035mol/L NaOH，37℃水解12h，HCl中和至pH7.0。正丁醇萃取水解液，将萃取液蒸干，质谱测定碱水解得到的开环化合物。

　　 1.5 抗植物致病真菌活性

    供试菌 小麦赤霉病菌（Fusarium graminea-rum）、黄瓜枯萎病菌［Fusarium oxgsporum（Sch1）f.sp cucumerium Owen］、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers）均分离自患病植株。

    对植物致病真菌室内抑制活性测定 将H6794-A粉剂加水配成50、100、200和400倍稀释药液，对照药剂配成100和200倍稀释液，用时分别稀释10倍。制取含药培养基（9ml PDA+1ml药液），凝固后用打孔器切取正常培养基上的供试植物病原菌菌丝体移入其中，置25～26℃温箱中培养。6d后量取菌落直径，并根据菌落扩展直径的长度与对照组比较，求出抑制百分率。对照药剂分别为70%甲基托布津WP、50%速克灵WP、50%多菌灵超微WP。

　　2 结果

    2.1 活性产物的结构鉴定［5～7］ H6794-A为乳白色粉末，易溶于低级醇。紫外吸收为末端吸收。红外光谱（KBr压片）在3350、2924、28531、17431、1658和1462cm -1 等处有吸收峰。HR-ESI-MS（positive）实测值:m/z1189.6261（M+H） + ，分子式:C 54 H83 N 11 O 19 ，理论值:1190.3。

    经LC/MS分析，H6794-A的酸水解产物含有6 种氨基酸:Asp、NMePhe、NMeAsp（来源于NMeAsn）、βOHGlu（来源于βOHGln）、βMeGlu、Ser，以及分子量为411的未知氨基酸衍生物。由13 C-NMR数据（δ71.4，J  CH =150Hz）显示存在含氧的四元环［8］ 。经检索未知氨基酸应为3-氨基-2氧氮杂环丁烷-4羧酸的酸水解开环产物。   

    至此，确定了组成H6794-A的各片段。碱水解开环产物的质谱给出碎片峰:342、457、558、644、755和934。结合HMBC得出连接顺序图2。

    综合紫外、红外、氨基酸分析、核磁共振、以及质谱的结果，所得H6794-A的结构如图3;H6794-A的NMR数据归属见表1。

    2.2 抗植物致病真菌活性

    H6794-A稀释500～4000倍对番茄灰霉病菌和小麦赤霉病菌有明显的抑菌作用，对黄瓜枯萎病菌也有一定的抑制作用（表2）。

     3 讨论

    H6794-A是通过几丁质合成抑制模型筛选得到，报道neopeptin B是葡聚糖合成酶抑制剂

    ［9］ ，由此可见H6794-A不仅是几丁质合成酶抑制剂，还是葡聚糖合成酶抑制剂。另外，文献报道neopeptin B能使菌丝膨大而抑制植物致病真菌，如:宫部旋孢腔菌（Cochliobolus miyabeanus）、菌环小丝壳菌（Glomerella cingulata）及Pyricularia oryzae，但未提及对其他植物致病真菌的活性，本文对H6794-A的抗真菌活性进行了补充:室内生测表明H6794-A还对番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌和黄瓜枯萎病菌有明显的抑制作用。下一步将进行田间仿效试验，以确定H6794-A的实用价值。

    致谢: 感谢农业大学潘贞德教授研究组帮助测定室内抑制活性。

【文献】
  　　［1］Hao Z F，Mao X，Li R Z.Strategies and advances in improving resistance to funga1pathogens by transgenic approaches ［J］.Biotechnol Bull（生物技术通报），2001，6 （1）:5

［2］Prabhavathi B，Fernandes.New approaches for antifungal drugs ［M］.Boston:Birkhauser，1992:1

［3］Donald R K，Margaret H L.A modified screen for the detection of cell wall-acting antifungal compounds ［J］.J Antibiot，1986，39（11）:1620

［4］Fujii K，Shimoya T，Ikai Y，et al.Further application of advanced Merfey′s method for determination of absolute configuration of primary amino compound ［J］.Tetrahe-dron Lett，1998，39（17）:2579

［5］宁永成.有机化合物结构鉴定与有机波谱学（第二版）［M］.北京:出版社，2000:131

［6］Eberhard，Breitmaier.Structure elucidation by NMR in organic chemistry——a practical guide ［M］.England:Wiley Press，1993:7

［7］Jeremy K，Sanders M，Brian K H.Modern NMR spec-troscopy——a guide for chemists（2 nd edition）［M］.Oxford:Oxford University Press，1993:113

［8］Stothers J B.Carbon-13NMR spectroscopy ［M］.New York:Academic Press，1972:342

［9］Makoto U，Masakazu J，Jun U，et al.Neopeptins A，B，C，Inhibitors of fungal cell wall glucan synthasis