高效液相色谱法测定呋苄西林钠含量与有关物质

           作者：潘颖 项竞佐 刘浩 仇仕林

【摘要】  目的 建立呋苄西林钠含量与有关物质的HPLC分析方法。方法 采用ODS柱，以磷酸盐缓冲液(0.05mol/L磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节pH值至3.5)∶乙腈(75∶25)为流动相A；以磷酸盐缓冲液∶乙腈(20∶80)为流动相B，含量测定以流动相A进行等度洗脱，有关物质测定采用线性梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为254nm。结果 呋苄西林在0.0964～19.29μg的范围内，进样量与峰面积的线性关系良好(r=0.9999)，最低检测限为1.2ng。结论 本方法可用于呋苄西林钠的有关物质及含量测定，方法专属性强，重现性好，操作简便。

【关键词】  呋苄西林钠 有关物质 含量测定 高效液相色谱

    Determination of furbenicillin sodium and its related substances by HPLC

      ABSTRACT  Objective  To establish a new method for determination of furbenicillin sodium and its related substances.  Method  An ODS column was used. Mobile phase A: phosphate buffer (0.05mol/L potassium dihydrogen phosphate solution, pH adjusted to 3.5 by phosphoric acid)∶acetontrile (75∶25), mobile phase B: phosphate buffer∶acetontrile (20∶80), isocratical elution was used for content determination and linear gradient elution for related substances. The flow rate was 1.0ml/min. The detection wavelength was 254nm. Results  The relationship between sample sizes (a range from 0.0964μg to 19.29μg) and peak areas had showed a good linearity (correlation coefficient r=0.9999). The detection limit is 1.2ng.  Conclusion The method can be used to analyze furbenicillin sodium qualatively and quantitively. The method is easy, highly specific, efficient and reproducible.

    KEY WORDS  Furbenicillin sodium;  Related substances;  Content determination;  HPLC

     呋苄西林钠(furbenicillin sodium)为氨基青霉素的脲基衍生物，有较强的抗菌活性。对不产青霉素酶金葡菌、肺炎球菌、A组溶血性链球菌、草绿色链球菌、肠球菌属的抗菌作用与哌拉西林相仿［1］。

    呋苄西林钠(呋脲苄青霉素钠)为卫生部药品标准抗生素药品(第一册)1989年版所收载(标准编号为WS1?C2?0021?89)，其含量测定方法采用酸碱法和碘量法之综合容量法，不但专属性差，且操作方法和过程均很繁琐复杂。本文建立了反相高效液相色谱法测定呋苄西林钠的含量及有关物质，其专属性强，重现性好，操作简便。

    1  仪器和试药

    1.1  仪器

    Agilent 1100高效液相色谱仪系列，包括四元泵、可变波长检测器、自动进样器和ChemStation工作站。

    1.2  试药

    乙腈为色谱纯试剂，磷酸二氢钾、磷酸均为分析纯。呋苄西林对照品为本所标定的工作对照品，纯度为97.3%。呋苄西林钠共6批，分别来源于两个不同的生产单位。

2  实验方法与结果

    2.1  色谱条件

    色谱柱：Merck Lichrosper 100 RP?18e(250mm×4.0mm，5μm)；流动相A：磷酸盐缓冲液(0.05mol/L磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节pH值至3.5)∶乙腈(75∶25)；流动相B：磷酸盐缓冲液∶乙腈(20∶80)；含量测定以流动相A进行等度洗脱；有关物质进行线性梯度洗脱，0～15min：A为100%，B为0；45min：A为0，B为100%；55min：A为100%，B为0。流速1.0ml/min，检测波长254nm；进样体积10μl。

    2.2  测定法

    (1)有关物质  取本品约50mg，精密称定，置25ml量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。两个生产产品的有关物质色谱图分别见图1、图2。

    (2)含量测定  取本品及对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成每1ml中含0.2mg的溶液，分别作为供试品溶液和对照品溶液。两个生产企业的供试品溶液色谱图分别见图3、图4。

    2.3  方法学考察

    (1)线性范围  精密称定呋苄西林对照品适量，用流动相分别稀释成0.0964、0.1929、0.964、1.929、9.64、19.29μg/ml的溶液，记录色谱峰面积，将所得呋苄西林峰峰面积与进样量作线性回归，得回归方程为：

    A=1523.9C+79.045  r=0.9999

    图1    甲企业有关物质色谱图(呋苄西林保留时间为13.651min)

    图2    乙企业有关物质色谱图(呋苄西林保留时间为13.661min)

    图3    甲企业含量测定的供试品溶液色谱图图4    乙企业含量测定的供试品溶液色谱图(下转第767页)(上接第  页)提示在0.0964μg～19.29μg的范围内，进样量与峰面积的线性关系良好。

    (2)方法精密度  取某一批供试品共6份，分别进样，所得峰面积的相对标准偏差为0.03%。

    (3)最低检测限  以信噪比为3，所得最低检出限为1.2ng。

    (4)耐用性考察  采用三根不同品牌的色谱柱，(a)大连依利特公司Hypersil BDS C18(4.6mm×250mm，5μm)；(b)TSK公司TSK?Gel ODS?100S(4.6mm×150mm，5μm)；(c)Merck公司Lichrosper 100 RP?18e(4.0mm×250mm，5μm)，三根色谱柱均可将呋苄西林及有关物质良好分离。本文图谱均采用Merck柱的色谱图。

    3  讨论

    (1)流动相中缓冲液pH值的选择  根据磷酸盐的pKa值，本文分别选择了pH7.0、pH5.0和pH3.5的0.05mol/L磷酸二氢钾溶液∶乙腈(75∶25)为流动相。试验发现，随着流动相中缓冲液pH值的降低，呋苄西林峰的保留时间增加，主峰与相邻杂质峰的分离度增加。并且当缓冲液pH值为3.5时，色谱系统最为稳定，因此本文选定了pH3.5的磷酸二氢钾溶液?乙腈作为流动相。

    (2)检测波长的确定  本文曾采用220nm为检测波长，但经与以254nm作为检测波长的测定的色谱图相比较，并未发现更多的杂质被检出。考虑到254nm波长检测基线的漂移较小，更适合梯度洗脱，因此本文选254nm为检测波长。

    (3)有关物质的测定结果  本文采用归一化法初步了有关物质的量，所得的结果见表1。表1    有关物质测定结果 从表1可见，生产企业乙的有关物质量明显偏高，同时从图2中也可发现除呋苄西林主峰外有很多未知杂质峰。这些未知杂质的结构有待进一步研究。

    (4)两种含量测定方法结果比较  从表2可见，容量分析法测得的结果与高效液相色谱法测得的结果相比明显偏高，表明原容量分析方法专属性太差，其测定结果不能反映样品的真实质量。表1、表2的结果说明目前市场上销售的呋苄西林钠及注射用呋苄西林钠产品存在了很大的质量问题。表2      高效液相色谱法和容量分析法测定结果

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  ［1］ 戴自英. 实用抗菌药物学(第二版)［M］. 上海：上海技术出版社，1998：121