海洋来源真菌A?f?11中吲哚二酮哌嗪类抗肿瘤活性成分的研究

           作者：赵文英 张亚鹏 朱天骄 方玉春 刘红兵 顾谦群， 朱伟明  

【摘要】  对海洋来源具有抗肿瘤活性的真菌A?f?11中活性次级代谢产物进行了研究，采用活性追踪的方法从乙酸乙酯提取物中分离得到7个含吲哚基的二酮哌嗪类化合物，根据化合物的光谱特征和理化性质分别鉴定为cyclo?L?tryptophyl?L?proline (1)，N?Prenyl?cyclo?L?tryptophyl?L?proline (2)，tryprostatin B (3)，demethoxyfumitremorgin C (4)，fumitremorgin C (5)，cyclotryprostatins B (6)和fumitremorgin B (7)，其中化合物2为新天然产物。利用丽丝胺罗丹明法，对7个单体化合物的抗肿瘤活性进行了初步评价。

【关键词】  海洋来源真菌 吲哚二酮哌嗪 抗肿瘤活性

    Studies on the indolyl diketopiperazine analogs produced

     ABSTRACT  To investigate the antitumor secondary metabolites of marine?derived fungal A?f?11. Seven indolyl diketopiperazine compounds were isolated with bioassay?guided separation procedure. The structures of these compounds were determined through extensive analysis of 1D and 2D?NMR data. Their antitumor activities against K562 cell lines were preliminarily evaluated by the lissamine rhodamine B method. Compound 2 was a new natural product.

    KEY WORDS  Marine?derived fungus;  Indolyl diketopiperazine compounds;  Antitumor activity

     由于海洋环境的特殊性，赋予生活在海洋中的真菌在生理性状和遗传背景上与陆生真菌具有显著差异，因此从海洋来源真菌代谢产物中寻找有效的抗肿瘤先导化合物引起国内、外学者的关注。经过多年的不懈努力，人们已经相继从海洋来源的真菌中分出许多结构新颖的具有抗肿瘤活性的化合物，其中以生物碱类成分居多。天然产物中的生物碱都是由氨基酸衍生而成的，其中二酮哌嗪类生物碱具有显著生理活性，如由苯丙氨酸和丝氨酸衍生的gliotoxin［1］是一种真菌毒素，具有很强的细胞毒活性和免疫抑制作用；喹唑酮类生物碱fumiquinozolinesA?I［2］是由色氨酸和邻氨基苯甲酸衍生的，具有中等强度的细胞毒活性和抗真菌活性等。

    近年来本实验室利用人慢性髓性白血病细胞(K562)的流式细胞术筛选模型开展了从海洋微生物中寻找新的细胞周期抑制剂和细胞凋亡诱导剂等抗肿瘤先导化合物的研究工作。从海洋样品中分离纯化了近千株微生物菌株，对其发酵产物进行活性筛选。其中从青岛近海海泥样品中分离出真菌A?f?11的发酵物显示有明显的坏死性细胞毒活性和细胞周期抑制作用，采用活性追踪的分离方法从其活性部位中分离得到７个含吲哚基的二酮哌嗪类化合物。本文主要报道该类化合物的提取分离、结构鉴定和抗肿瘤活性。

    1  材料与方法

    1.1  仪器与试剂

    质谱用Autospec?Ultima?TOF型质谱仪，核磁共振谱用日本JEOL JNM?ECP600型核磁共振仪测定。分析用高效液相色谱仪：Waters公司产品［Waters 600，Waters 996二极管阵列检测器，Millennium32工作站，Capcell Pak C18柱：(4.6mm×250mm，5μm)］。制备用高效液相色谱仪：日本岛津公司产品［LC?6AD，SPD?M20 AVP检测器，SCL?10AV型系统控制器，Capcell Park C18柱：(20mm×250mm，5μm)］。柱层析及薄层层析用硅胶H(10～40μm)：青岛海洋化工集团公司。SephadexTM LH?20：Pharmacia公司。活性测试采用K562细胞。胎牛血清(FBS)和RPMI?1640细胞培养基分别为Hyclone公司(Cat.No.STF721)和Gibcobrl公司产品。丽丝胺罗丹明B((lissamine rhodamine B，SRB)为Sigma公司产品。

    1.2  菌种发酵

    按培养微生物的常规方法取真菌适量，接种到PDA琼脂固体斜面培养基上，在28℃培养箱中培养7d。用接种针挑取适量孢子和菌体，接种到含100ml种子培养液的500ml三角烧瓶中，置摇床中，在28℃、120r/min条件下培养48h，获得种子培养液。

    取该种子培养液适量，按5%的接种量接种到内装150ml培养液的500ml三角烧瓶中，置28℃、120r/min的摇床上发酵7d，获得菌株的发酵培养液。

    1.3  菌株提取物的制备

    将菌株的发酵培养液离心，分为上清液和菌丝体。取上清液，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，得上清液的乙酸乙酯萃取液。菌丝体用80%丙酮水溶液超声破碎提取3次，合并提取液，减压浓缩至不含丙酮后，用乙酸乙酯萃取三次，萃取液与上清液的乙酸乙酯萃取液合并，减压浓缩至干，得到该菌株的乙酸乙酯萃取物(粗提物35g)。

    1.4  活性成分的追踪分离

    取菌株发酵培养物的粗提物，以石油醚?丙酮为洗脱溶剂系统进行减压柱层析，共得到10个组分。采用K562细胞为筛选模型，检测每个组份的活性。活性组分Fr.6经Sephadex LH?20，氯仿∶甲醇(1∶1)洗脱，得Fr.6?4，重结晶得化合物7(39mg)。活性组分Fr.8经常压柱层析，用CHCl3洗脱，得到5个组分，其中Fr.8?3重结晶得化合物1(80mg)。活性组分Fr.9减压柱层析，以氯仿?甲醇混合溶剂为洗脱系统，得到9个组分。其中Fr.9?6经半制备反相高效液相色谱，乙腈∶水(30∶70，V/V)洗脱，分别得到化合物2(5mg)、3(11mg)、4(25mg)、5(34mg)和6(4.6mg)。

    1.5  活性测试

    按照［3］采用SRB法，结合显微镜观察细胞形态变化。

    2  结果与讨论

    2.1  化合物结构鉴定

    化合物1淡黄色结晶(氯仿)，ESI?MS给出284［M+H］+伪分子离子峰，结合1H和13C?NMR谱，推出分子式为C16H17N3O2。IR谱中给出1674和1652cm-1典型的酰胺羰基吸收，与13C?NMR中的δ169.3和165.5处的信号相对应，提示该化合物为二氧哌嗪类。1H?NMR中显示有邻二取代的苯环(δ7.58d，J=8.0Hz，4?H；δ7.37d，J=8.0Hz，7?H；δ7.22td，J=8.0，1.1Hz，6?H；δ7.14d，J=8.04，1.1Hz，5?H)；13C?NMR和DEPT谱中给出2个酰胺羰基信号和苯环上的碳信号，还显示有1个sp2杂化的季碳信号(δ109.5)，3个次甲基(其中1个sp2杂化)和4个亚甲基信号，推测结构中可能含有吲哚环。从1H?1H COSY和HMQC谱推出分子中有脯氨酸残基， 结合HMBC谱并根据文献数据［4］，得出化合物1为cyclo?L?tryptophyl?L?proline(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。

    化合物2黄色油状，ESI?MS给出352［M+H］+、374［M+Na］+和390［M+K］+伪分子离子峰，结合1H和13C?NMR谱，推出分子式为C21H25N3O2。比较化合物1和2的1H和13C?NMR谱，两者极其相似，2比1多出2个甲基、1个亚甲基、1个烯烃质子信号和1个sp2杂化季碳信号而缺少了1个N上活泼氢信号，推测其N上氢被1个异戊烯基所取代。与文献［5］相对照，确定该化合物为N?Prenyl?cyclo?L?tryptophyl?L?proline，2000年Sanz?Cervera等曾合成出此化合物，本文首次从天然产物中分离(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。

    化合物3白色结晶(氯仿)，ESI?MS给出352［M+H］+伪分子离子峰，与化合物2为同分异构体，分子式为C21H25N3O2。比较2和3的1H和13C?NMR谱，发现3比2少了1个sp2杂化的次甲基，而多了1个N上的活泼氢，并且在2中与N相连的烯丙基质子也由δ4.67向高场移至δ3.46。推测在化合物2中连在N上的异戊烯基转移到与N相邻的2位上。与文献对照［6］确定该化合物为tryprostatin B(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。

    化合物4白色结晶(氯仿)，ESI?MS给出350［M+H］+和372［M+Na］+伪分子离子峰，结合1H和13C?NMR谱，推出分子式为C21H23N3O2。比较化合物4和3的1H和13C?NMR谱，4比3少了1个N上的活泼氢和1个亚甲基(δ3.46)，而在δ6.04处多了1个次甲基信号。推测异戊烯基上的亚甲基与邻近哌嗪环上的N相连形成1个新的环。对照［6］，确定该化合物为demethoxyfumitremorgin C(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。

    化合物5为淡黄色结晶(氯仿)，ESI?MS给出380［M+H］+和402［M+Na］+伪分子离子峰，结合1H和13C?NMR谱，推出分子式为C22H25N3O3。化合物5的1H?NMR信号比4多了1个甲氧基信号(δ3.81)，而在低场显著的1，2?二取代苯环信号被1，2，4?三取代的苯环信号所取代，因此推测化合物5是化合物4的甲氧基衍生物。这一推测也被13C?NMR上出现的甲氧基信号(δ55.7)和连氧的sp2杂化的季碳(δ156.3)所证实。对照文献［6］确定化合物5为fumitremorgin C(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。

    化合物6白色结晶(氯仿)，ESI?MS给出448［M+Na］+和462［M+K］+伪分子离子峰，结合1H和13C?NMR谱，推出分子式为C23H27N3O5。从13C?NMR谱上比较，化合物6比5多了1个甲氧基(δ56.595)和1个连氧季碳(δ84.7)，少了1个亚甲基，并且次甲基向低场移了20.2(δ76.8)，推测其与氧相连。其他碳谱数据基本相同。结合1H?NMR谱数据并对照文献［7］，推出该化合物为cyclotryprostatins B(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。

    化合物7淡黄色结晶(氯仿)，ESI?MS给出981［2M+Na］+和997［2M+K］+伪分子离子峰，结合1H和13C?NMR谱，推出分子式为C27H33N3O5。从1H和13C?NMR谱上比较，化合物7比6多了2个甲基(δC 18.0，δH 1.84；δC 25.3，δH 1.68)、1个亚甲基(δC 41.5，δH 4.52)和1个次甲基(δC 120.2，δH 5.01)，1个季碳(δC 134.3)信号，其余信号基本(下转第764页)(上接第  页)相同，推测化合物7比6多了1个异戊烯基，并且N1上的活泼氢信号消失，所以多出的这个异戊烯基应连在N1上。这一推测可从HMBC谱上得到证实，23?H与9?C和2?C有相关性。对照文献［8］确定化合物7为fumitremorgin B(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。

    2.2  抗肿瘤生物活性测试

    采用SRB法测定了7个化合物的抗肿瘤活性，结果表明，化合物2～7具有弱的细胞毒活性，抑制率分别为19.7%(50μg/ml)、17.4%(10μg/ml)、11.5%(1μg/ml)、25.6%(10μg/ml)、13.1%(1μg/ml)、14.3%(1μg/ml)；这些化合物的抗肿瘤作用在1～100μg/ml范围内不具有浓度依赖性，化合物1未表现出抗肿瘤活性。

    化合物1～7是从海洋真菌中分到的一系列由简单的环二肽衍生成的生物碱，其中化合物2～7又通过1经异戊烯基化衍生而成。早在20世纪70年代，人们就发现这类化合物属于真菌毒素，能使实验动物产生震颤，最近这类化合物更因其独特的生理活性和特殊的化学结构受到广泛关注。Cui等［6］证实这类化合物对小鼠tsFT210细胞有周期抑制活性，将肿瘤细胞抑制在G2/M期。Sanz?Cervera等［5］发现这类化合物对微管聚集有抑制作用，并且芳环上的甲氧基取代对其活性有影响，甲氧基可减弱细胞毒活性而增强干扰微管的活性。本文活性测试表明，这类化合物对K562细胞有弱的细胞毒活性，据文献报道，色氨酸残基上的α?C上的取代基为β取向的化合物的活性比α取向的活性明显增强，为证实这推测，我们将采取化学合成的方法对其结构进行改造，其构效关系正在进一步的研究中。

【文献】
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［3］ Skehan P, Storeng R, Scudiero D, et al. New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drug screening ［J］. J Natl Cancer Jnst,1990,82:1107

［4］ Birch A J, Russell R A. Studies in relation to biosynthesis?XLIV: structural elucidations of brevianamides ?B, ?C, ?D, and ?F ［J］. Tetrahedron,1972,28:2999

［5］ Sanz?Cervera J F, Stocking E M, Usui T, et al. Synthesis and evaluation of microtubule assembly inhibition and cytotoxicity of prenylated derivatives of cyclo?L?trp?L?pro ［J］. Bioorg Med Chem,2000,8:2407

［6］ Cui C B, Kakeya H, Osada H. Novel mammalian cell cycle inhibitor, tryprostatins A, B and other diketopiperazines produced by Aspergillus fumigatus II. physico?chemical properties and structures ［J］. J Antibiot,1996,49(6):534

［7］ Cui C B, Kakeya H, Osada H. Novel mammalian cell cycle inhibitor, cyclotryprostatins A?D, produced by Aspergillus fumigatus, which inhibit mammalian cell cycle at G2/M phase ［J］. Tetrahedron,1997,53(1):59

［8］ Nakatsuka S I, Teranishi K, Goto T. Total synthesis of fumitremorgin B ［J］. Tetrahedron Lett,1986,27(52):6361