高效液相色谱法测定人血浆中依诺沙星含量及药动学研究

                   作者：孙亚欣 丁艳萍 何晓静 肇丽梅

【摘要】  目的 建立测定人血浆中依诺沙星浓度的高效液相色谱方法。方法 血浆样品经甲醇沉淀蛋白后，以乙腈∶0.05mol/L柠檬酸缓冲液(15∶85，pH3.5)为流动相，经Hypersil?BDS C18(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱分离，345nm波长检测。结果 依诺沙星在0.05～5.0μg/ml浓度范围内线性关系良好，低、中、高三个浓度的提取回收率为44.8%～51.1%，日内、日间相对标准差为3.15%～6.61%。结论 本方法准确、快速，可满足临床药动学研究的要求。

【关键词】  依诺沙星 高效液相色谱法 药动学

    Determination of enoxacin in human plasma by

      ABSTRACT  Objective  An HPLC method was established for determination of enoxacin in human serum.  Methods  Serum protein was precipitated with methanol. The analysis was conducted with a Hypersil?BDS C18 (4.6 mm×150 mm, 5μm) column, acetonitrile∶0.05 mol/L citric buffer (15∶85, pH3.5) as mobile phase, and the detecting wavelengh was at 345 nm.  Results  The linear range enoxacin was 0.05～5.0 μg/ml and the recoveries were in the range of 44.8%～51.1% at three different concentrations. The RSD of intra? and inter?day were in the range of 3.15%～6.61%.  Conclusion  This method is suitable for the pharmacokinetic study of enoxacin.

    KEY WORDS  Enoxacin;  HPLC;  Pharmacokinetics

     依诺沙星又名氟啶酸，是第三代喹诺酮类广谱抗生素，通过作用于细菌DNA螺旋酶，抑制细菌DNA的合成和复制而导致细菌死亡。临床上用于敏感菌所致的急性呼吸系统、泌尿系统、消化道及皮肤软组织等感染的［1］。有关依诺沙星浓度测定的方法国内、外都有报道，有采用LC/MS/MS法［2］、荧光法［3］、微生物法［4］、微透析法［5］，常用HPLC紫外检测［6，7］。本文建立了测定血浆中依诺沙星的高效液相色谱法，该方法简便，快捷，并研究了该药的体内药动学行为，为临床研究提供方法和依据。

    1  仪器与试药

    HP?1100系列高效液相色谱仪(Agilent公司)，GL?20G?II高速冷冻离心机(上海安亭仪器厂)。依诺沙星对照品(含量99.7%，山东罗欣药业股份有限公司提供)；依诺沙星片(山东新华制药股份有限产品，规格为每片200mg，批号0501084)。甲硝唑对照品(内标物，药品生物制品检定所)；乙腈、甲醇为色谱纯；柠檬酸和三乙胺均为分析纯。空白血浆由中国医科大学附属二院输血科提供。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件

    色谱柱为Hypersil?BDS C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为乙腈∶柠檬酸缓冲液(15∶85，pH3.5)(缓冲盐为每1000ml溶液加三乙胺6ml调至pH3.5)；流速1.0ml/min；检测波长345nm；柱温30℃。

    2.2  血浆样品处理

    取血浆样品0.5ml，于具塞塑料离心管中，补加50μl甲醇，加入内标(10μg/ml甲硝唑甲醇溶液)50μl，加甲醇1.0ml涡旋混合1min，10000r/min离心10min，移取上清液于另一洁净试管中，55℃氮气吹干上清，200μl甲醇溶解残渣，取20μl上清液进样，记录色谱图。

    2.3  标准曲线

    取0.5ml空白血浆，依次加入浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0和50.0μg/ml的依诺沙星标准系列的甲醇溶液50μl，配制相当于0.05、0.10、0.25、0.50、1.0、2.5和5.0μg/ml的血浆样品，按“2.2”项下的方法操作，制备标准曲线。以待测物浓度C为横坐标，待测物与内标物的峰面积比(Y)为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，得直线回归方程：

    Y=0.8612C-0.00047  r=0.9977(n=3)

    2.4  方法专属性考察

    在上述色谱条件下测得空白血浆、空白血浆加入标准品及实测血浆样品的谱图(Fig.1)。在本实验条件下依诺沙星的保留时间约为3.05min，内标甲硝唑保留时间约为4.48min，血浆内源性物质对依诺沙星及甲硝唑无干扰。

    2.5  方法精密度和回收率

    制备浓度分别为0.1、0.5和2.5μg/ml的依诺沙星标准血浆样品作为质控(QC)样品，按“2.2”项下依法操作，每个浓度6个样本，连续测定3d，以当日的标准曲线样品的测得浓度，与配制的浓度对照，求得本法的精密度与准确度。另取相当于0.1、0.5和2.5μg/ml的标准品稀释液，进样20μl，记录峰面积，考察提取回收率。结果见Tab.1。

    2.6  稳定性考察

    按“2.5”项下方法分别配制低、中、高三个浓度QC样品，每个浓度进行6样本分析经提取，室温放置24h测定，结果RSD＜3%，表明血浆样品室温放置24h稳定。同法配制低、中、高三个浓度的QC样品，经反复三次-20℃冰冻，室温融化后测定样品浓度，结果RSD＜5%，表明血浆样品在冻融条件下稳定。

    2.7  药动学研究

    A: Blank plasma;  B: Plasma with standard material (2.5 μg/ml);

    C: Plasma sample 1.5h after a single dose  1: Enoxacin;  2: IS

    经医学伦理委员会批准，选择健康男性志愿者20名，平均年龄(22.4±0.8)岁，平均身高(1.73±0.05)m，平均体重(65.4±4.57)kg，试验前体格检查心电图、肝、肾功能等各项指标均为正常。由本人签署知情同意书。试验日晨空腹服用依诺沙星片400mg，分别于给药前和给药后0.33、0.67、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、9.0、12.0和24.0h取静脉血4ml，置肝素离心管中，离心、分离血浆，按“2.2”项下方法操作，测定血浆中依诺沙星的浓度，主要药动学参数tmax、cmax、t1/2和AUC分别为(1.29±0.59)h、(3.47±0.84)μg/ml、(7.23±1.20)h和(21.5±4.23)μg·h/ml。平均药时曲线见Fig.2。

    3  讨论

    依诺沙星的标准品溶液经紫外扫描，最大吸收波长分别在274和345nm，在实际测定中我们采用345nm，虽然没有274nm处响应值高，在实验条件下血浆内源性杂质对样品和内标无干扰，且可满足体内样品分析测定的需要。

    本试验优化了不同提取液、流动相，发现流动相在pH3.5的条件下分析依诺沙星和内标可得到很好的分离，且峰形对称。采用有机溶剂提取、酸沉的方法均有内源性干扰，而采用甲醇和乙腈直接沉淀蛋白的方法无内源性干扰，用甲醇提取回收率相对要高，虽然回收率仅为50%左右，但高、中、低三个浓度下的提取回收率非常一致，提取物室温放置稳定，且无内源性杂质干扰，重现性好。每个样品的分析时间仅为5min，适合

    本文所获得的药动学参数与国内外［8，9］报道一致，为该药临床安全有效的应用及个体化给药提供了依据。本文所用的方法准确、灵敏、快速，适用于药动学研究。

【参考文献】
  ［1］ Henwood J M, Monk J P. Enoxacin. A review of its antibacterial activity, pharmacokinetic properties and therapeutic use ［J］. Drugs,1988,36(1):32

［2］ 周虹. LC/MS/MS法同时测定食品中喹诺酮类药物［J］. 口岸卫生控制，2005，10(3)：40

［3］ Espinosa?Mansilla A, Pena A M, Gomez D G, et al. HPLC determination of enoxacin, ciprofloxacin, norfloxacin and ofloxacin with photoinduced fluorimetric (PIF) detection and multiemission scanning application to urine and serum ［J］. J Chromatogr B,2005,822:185

［4］ 张莉蓉，乔海灵，王海学. 依诺沙星胶囊在健康人体的药物动力学及相对生物利用度［J］. 临床药学杂志，2002，11(2)：89

［5］ 刘志东，李佳玮，张立波. 微渗析技术研究依诺沙星眼用缓释凝胶剂兔眼内药动学［J］. 中国新药杂志，2005，14(7)：867

［6］ 李彬，王海意，吴鸿范. 高效液相色谱法测定血清中依诺沙星浓度［J］. 天津医科大学学报，1995，1(1)：30

［7］ Davis J D, Aarons L, Houston J B. Simultaneous assay of fluoroquinolones and theophylline in plasma by high?performance liquid chromatography ［J］. J Chromatogr,1993,621(1):105

［8］ 张菁，张婴元，任建忠，等. 国产依诺沙星片剂的生物利用度及药动学参数［J］. 上海医科大学学报，1994，21(5)：339

［9］ Jaehde U, Sorgel F, Naber K G, et al. Distribution kinetics of enoxacin and its metabolite oxoenoxacin in excretory fluids of healthy volunteers ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1995,39(9):2092