提高白色链霉菌盐霉素产量的工艺研究
【摘要】 以白色链霉菌SL?F2?110为产生菌，着重从菌种选育和补料工艺两方面研究提高白色链霉菌的盐霉素产量。结果表明，①氯化锂前处理与紫外线复合处理后筛选出的突变株盐霉素发酵产量有很大提高；②在基础培养基中减少豆油加量，采用中间补豆油控制，发酵水平与没有补料的相比有较大提高。
【关键词】 盐霉素； 白色链霉菌； 发酵工艺
Study on the improvement of fermentation process for yield of salinomycin
ABSTRACT The study refers to the improvement of fermentation process for increasing the yield of salinomycin. Using Streptomyces albus SL?F2?110 as the producing strain, the yield of the fermentation can be increased largely with the method of mutagenesis induced by UV and LiCl and the optimization of the bean oil feeding for salinomycin fermentation process.
KEY WORDS Salinomycin; Streptomyces albus; Fermentation process
盐霉素(salinomycin)是从白色链霉菌(Streptomyces albus)的深层培养液中分离得到的一种聚醚类抗生素，由6分子乙酸，6分子丙酸和3分子丁酸提供的相应酰基缩合而成［1～2］。日本于1979年批准盐霉素用作球虫病防治剂，1987年欧共体批准盐霉素用作抗球虫剂和促生长剂，1993年我国农业部正式批准其作同样的用途。盐霉素作为禽用抗球虫剂在世界范围内得到普及，应用前景将十分广泛。
抗生素发酵水平的提高，主要取决于菌种改良和培养工艺优化［3］。为提高白色链霉菌中盐霉素产量，在过去工作的基础上［4～7］，我们从菌种选育和补料工艺两方面进行研究，以期提高盐霉素的生产水平。
1 材料与方法
1.1 菌种
供试菌株为白色链霉菌(Streptomyces albus)SL?F2?110。
1.2 培养基 斜面培养基 高氏一号培养基。
摇瓶培养基(g/L) 牛肉膏5，酵母粉3，氯化钾2，丙三醇20，消泡剂1。
种子培养基(g/L) 葡萄糖15，黄豆粉20，小麦胚芽10，碳酸钙3，牛肉膏5，酵母粉3，氯化钾2，丙三醇20，KH2PO4 1，消泡剂1。pH6.5～7.0。
发酵培养基1(不补料工艺)(g/L) 硫酸铵5，黄豆粉30，豆油85，,KH2PO4 1，MgSO4 1.2，碳酸钙5，食盐3，消沫剂1。pH6.5～7.0。
发酵培养基2(补豆油工艺)(g/L) 硫酸铵5，黄豆粉30，豆油50，KH2PO4 1，MgSO4 1.2，碳酸钙5，食盐3，消沫剂1。pH6.5～7.0。
效价测定培养基(%) 蛋白胨0.3，酵母粉0.3，葡萄糖0.1，琼脂粉1.4。pH6.8～7.0。
1.3 实验规模
摇瓶种子 250ml三角瓶内装25ml培养基，接入成熟斜面孢子， 33℃于摇床培养70h左右， 转速220r/min。
种子培养 20L种子罐装12L培养基，接入摇瓶种子，接种量120ml，罐温35℃，罐压0.05Mpa，搅拌转速500r/min，通气比为1∶0.5vvm，培养30h左右。
发酵培养 50L发酵罐装培养基30L，从种子罐取种3L接入，罐温33℃，罐压0.05Mpa，搅拌转速400r/min，通气比为1∶0.5vvm，中途采用补加豆油工艺与不补料工艺两种方式，12d放罐，测定放罐液效价。
1.4 测定方法
还原糖测定 斐林试剂法。
氨基氮测定 甲醛法。
盐霉素效价测定 以杯碟法测定，检定菌为短小芽孢杆菌。
豆油和脂肪酸的测定 按［8］进行。
脂肪酶活力的测定 37℃下，将1ml发酵液每分钟分解底物产生1μmo1脂肪酸定义为一个酶活单位。
菌丝浓度的测定 10ml发酵液于离心管内3000r/min离心10min，测量上清液体积，得出：
菌丝浓度(%)=(10-上清液体积)÷10×100%
1.5 诱变方法
(1)悬浮液制备 将生产用SL?F2?110孢子斜面，加蒸馏水l0ml，制成孢子悬液，倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，置旋转摇床振荡15min，然后用滤纸过滤，使成单孢子悬液，供诱变处理用。
(2)氯化锂处理 选用0.05%、0.10%、0.30%三种浓度进行处理。氯化锂与培养基按上述比例混合后置平皿培养3～5d，观察敏感度，10d观察菌落形态，过筛后进行摇瓶发酵试验，比较突变株与对照株的效价。
(3)氯化锂与紫外线复合处理
氯化锂前处理 制成0.30%氯化锂的单孢子悬浮液，28℃振荡4h，取5ml于无菌平面皿中，置波长253nm、功率30w的紫外灯下30cm处，磁力搅拌照射一定时间，立即稀释分离于平皿。
氯化锂后处理 单孢子悬浮液，在摇床上振荡培养4h，取5ml于无菌平面皿中，置波长253nm、功率为30w的紫外灯下30cm处，磁力搅拌照射一定时间进行分离于含0.30%氯化锂的上层培养皿中培养。
2 结果与分析
2.1 分离
供试菌株SL?F2?110的单孢子悬液，经自然分离，从中获得一株新菌株lN?SL?F2?110作为出发菌株，效价49118u/ml，较SL?F2?110提高18%(41588u/ml)。
2.2 氯化锂处理
(1)氯化锂敏感度 以lN?SL?F2?110为出发菌株，用不同剂量的氯化锂处理，其敏感度结果见表1。
(2)突变菌株的菌落形态 以lN?SL?F2?110为出发菌株，经氯化锂处理后培养，形成的菌落形态有3种类型，3种菌落类型的菌株中分别挑出代表性菌株进行斜面培养，过筛，观察诱变后的变异率。其中圆帽状型(类型Ⅲ)的正变率为最高。结果见表2。
(3)氯化锂与紫外线复合处理 以lN?SL?F2?110为出发菌株，分别采用①氯化锂前处理与紫外线复合处理和②氯化锂后处理与紫外线复合处理，考察其诱变效应，同时以不经过诱变处理的各稀释浓度的单孢子悬浮液涂于空白平板作为对照，结果见表3。
表3结果表明，先用氯化锂前处理后再与紫外线复合处理对菌株的诱变效应较氯化锂后处理更好，正
表1 不同剂量氯化锂对出发菌株的敏感度 略
表2 三种典型菌落的菌株诱变后的变异率情况 略
表3 氯化锂与紫外线复合处理的诱变效应 略
(4)筛选结果比较 以lN?SL?F2?110为出发菌株，经单一的氯化锂处理后筛选出的正变率高氯?Ⅳ突变株和经氯化锂前处理与紫外线复合处理后筛选出的正变率高氯?UV?Ⅹ突变株，与1N?SL?F2?110菌株进行对比试验，筛选结果见表4。结果表明，经氯化锂前处理与紫外线复合处理后筛选出的突变株氯?UV?Ⅹ发酵水平最高，比原出发菌株提高54%，脂肪酶的活力比原出发菌株提高近两倍。
2.3 补豆油工艺
盐霉素的合成途径为聚多酮途径，起始单位是三碳单位丙二酰CoA。以植物油或动物油作为培养基碳源能提供更多的三碳和二碳单位，有利于盐霉素的合成。葡萄糖作碳源时，尽管也可以转化为短链脂肪酸参与盐霉素的生物合成，但大部分进入TCA循环而被作为能源。
豆油是盐霉素发酵的优良碳源，一方面豆油能为初级代谢提供碳骨架和能量，另一方面能为盐霉素的合成提供前提物质，促进盐霉素的合成。由于豆油对发酵液溶氧影响非常大，而且过量的豆油会吸附在菌丝体上，严重影响菌体生长和代谢，采用减少培养基中初始豆油含量和发酵过程中补加豆油的工艺，有助于提高盐霉素的发酵水平。
为提高盐霉素发酵水平，在原基础培养基中减少41%的豆油加量，采用中间补豆油控制。以豆油质量分数、脂肪酸质量分数以及脂肪酶活力为综合指标进行发酵补豆油工艺。补豆油分阶段进行。
在50L罐上发酵前144h，每24h的补油量(g)公式为：G=(5.0%-A%-B%)×27×100+C×10［其中A、B分别为豆油和脂肪酸质量分数(%)，C为豆油消耗速率(g/h)］；发酵的第144～168h期间，每8h补豆油80g；发酵第168h至发酵终止，用豆油消泡；发酵终止前8h停止补豆油。发酵过程中每24h取样测定豆油、脂肪酸质量分数、抗生素效价，计算豆油消耗速率、补油量。
结果表明，在初始发酵培养基中减少豆油质量分数，发酵过程分阶段进行补油，能够使豆油质量分数和豆油消耗稳定在一定水平，脂肪酸质量分数能保持在比较高的水平，发酵水平有大幅度上升。
2.5 补豆油工艺与没有补料工艺的比较
采用以豆油、脂肪酸质量分数和豆油消耗速率为指标的补油工艺，在50L发酵罐上连续进行8批试验，其发酵水平与没有补料的发酵相比效价提高22.3%，且该补油发酵工艺有很好的结果重现性，结果见表5。
3 结论
(1)氯化锂或紫外线复合氯化锂方式来诱变育种是筛选获得盐霉素高产菌株的有效手段。本研究通过氯化锂和紫外线复合氯化锂诱变成功，获得高产菌株具有较高的脂肪酶活力，比原出发菌株的脂肪酶活力提高近两倍，盐霉素增产达50%以上。
(2)比色测定发酵液中豆油、游离脂肪酸质量分数，间接计算出脂肪酶的活力，不仅可以知道不同发酵阶段菌体对豆油的分解能力，而且知道残油量及脂肪酸的利用情况。考察发酵过程中脂肪酶活力的动态变化，可作为控制发酵的一个参数。实验证明脂肪酶是由
表4 氯?Ⅳ、氯?UV?Ⅹ突变株与1N?SL?F2?110菌株摇瓶效价比较(略)
表5 补豆油工艺与不补料工艺结果比较 略
(3)盐霉素发酵过程中微生物产生的脂肪酶将豆油分解成甘油和脂肪酸，通过测定发酵液中的脂肪酸和豆油浓度，可以计算出脂肪酶活力，用于优化盐霉素发酵的补油工艺。
(4)在基础培养基中减少豆油加量，采用发酵中途分阶段补豆油方式可提高盐霉素发酵水平22.3%。该补料工艺的发酵结果重现性很好，为今后化生产提供了一定的经验。但是豆油补加时机和补加量是否合理，对盐霉素发酵水平有重要影响，需要进一步深入的研究。
【】
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