银杏叶提取物对H2O2诱导的晶状体上皮细胞Bcl-2和Bax表达的影响

        作者：李爽乐，罗清礼，李正时，官鹏，卢燕，江爱华

【摘要】  目的：观察银杏叶提取物（EGb761）对晶状体上皮细胞凋亡相关基因蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法：将离体培养的SD大鼠的晶状体上皮细胞分成3组:实验组用H2O2+EGb761处理，对照组用H2O2处理，空白对照组未做任何处理。用免疫组化的方法检测上皮细胞Bcl-2，Bax的表达，分析实验组、对照组和空白对照组的表达情况。 结果： Bcl-2蛋白表达的阳性细胞率:实验组随时间的延长而上升，24h时为(20.7±1.4)%，对照组则随时间的延长而下降，24h时为(2.6±0.6)%，空白对照组为(6.8±1.1)%；Bax蛋白表达的阳性细胞率：实验组随时间的延长无明显变化，24h时为(10.7±0.9)%；对照组则随时间的延长而上升，24h时为(33.4±4.6)%，空白对照组为(4.6±0.8)%。结论：EGb761通过使晶状体上皮细胞Bcl-2蛋白表达增加，Bcl-2/Bax减少，阻止氧化损伤所致的晶状体上皮细胞凋亡；细胞凋亡可能与白内障形成有关，EGb 761在早期白内障形成中可能起抑制作用。

【关键词】  银杏叶提取物 Bcl-2；Bax 氧化应激 晶状体 上皮细胞

    0引言

     白内障的发生与机体抗氧化损伤状态有关，老年性白内障患者房水中H2O2含量高于正常[1]，氧化应激可能与老年性白内障有关。我们模拟老年性白内障患者房水中H2O2浓度处理Sprague-Dawley(SD)大鼠晶状体上皮细胞，用免疫组化方法观察晶状体上皮细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达情况，并通过银杏叶提取物（EGb 761）对H2O2作用的晶状体上皮细胞Bcl-2和Bax表达影响的对比观察，旨在探讨氧化应激与抗氧化剂对晶状体上皮细胞凋亡的生物学行为之间的关系。

    1材料和方法

    1.1材料  CO2培养箱(美国)，超净工作台(苏州)，体视显微镜(上海)，Olympus光学显微镜(日本)，各种培养瓶和培养皿，孵育湿盒等。无酚红M199(Sigma)，按说明书配制成培养液，加入HEPES(Fluka) 25mmol/L，青霉素100kU/L,链霉素100kU/L，过滤、除菌、分装，-20℃保存。用前加入Ginaton(德国舒培大药厂，含EGb761 17.5g/ L)，葡萄糖氧化酶(Sigma)，300mL/L H2O2(上海，分析纯)，葡萄糖(上海，分析纯)，并调pH至7.2～7.4。0.01mol/L PBS pH7.6；0.5mol/L Tris/HCL pH7.6；羊血清 工作稀释度(1∶10)；双蒸水；300ml/L H2O2；一抗鼠抗人Bcl-2单克隆抗体为Santa Cruz Biotechnology 公司产品，4℃保存，工作稀释度 (1∶100)；一抗羊抗人Bax抗体为Santa Cruz Biotechnology 公司产品，4℃保存，工作稀释度(1∶100)； SP试剂盒为 ZYMED公司产品，4℃贮存，工作稀释度(1∶100)； DAB 为Sigma公司产品。

    1.2方法  四周龄SD大鼠，质量110±10g，雌雄兼用，无眼疾。购自华西医科大学动物实验中心。CO2吸入处死，摘取眼球，置于500kU/L青霉素生理盐水中冲洗，在无菌条件下取透明晶状体。将透明晶状体放入含M199 1.5mL的24孔培养板中，置温度37℃、95%湿度、50mL/L CO2培养箱中培育1～2h，备用。模拟老年性白内障患者房水中H2O2浓度对离体培养SD大鼠晶状体上皮细胞进行处理，分为H2O2 添加EGb761处理实验组(以下简称实验组)，H2O2处理对照组(以下简称对照组)，只有M199培养液的空白对照组(以下简称空白组)。在M199中加入0.95mmol/L葡萄糖、葡萄糖氧化酶1nkat、90μmol/L H2O2。可使H2O2浓度在8h内维持于90±5μmol/L。据报道[2,3]：葡萄糖与葡萄糖氧化酶反应产生O2，由于O2的抽氢反应而生成H2O2。为保持较为恒定的H2O2浓度，每8h更换相同条件的培养基。取3个透明晶状体为一组放入10cm大小，含M199 30mL培养皿中，置温度37℃，95%湿度、50mL/L CO2培养箱中培养。经下述处理后，分别于3，6，18，24h时间段取培养晶状体作指标测定。实验组，在上述培养液中加入0.95mmol/L葡萄糖、葡萄糖氧化酶1nkat、100mg/L EGb761及90μmol/L H2O2。对照组，在上述培养液中加入0.95mmol /L葡萄糖、葡萄糖氧化酶1nkat、90μmol/ LH2O2。空白组，只在M199中培养。将培养3，6，18，24h的鼠晶状体，沿赤道部完整剪下前囊，在体视显微镜下一分为二，细胞面向上平铺于载玻片上，干燥后将铺片置于4℃丙酮中固定10min，取出待干燥后放4℃冰箱保存备用。蒸馏水浸洗丙酮固定玻片，0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；置30mL/L H2O2 水溶液中室温10min，灭活内源性过氧化物酶活性；0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；100mL/L正常羊血清封闭，37℃10min后弃去血清；滴加一抗(1:100工作稀释度)室温30min后置4℃冰箱过夜，0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；滴加生物素标记的二抗(1:100)，37℃1h， 0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素(1:100)，37℃1h，0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；DAB显色1～5min；苏木素复染；脱水，透明，封片。每次实验以实验室提供的Bcl-2、Bax表达阳性的组织切片为阳性对照；以PBS替代一抗作为阴性对照。细胞质内出现棕黄色颗粒为Bcl-2、Bax表达阳性细胞，细胞质无着色者为阴性细胞。细胞核均被染成兰色。每组5张细胞铺片，每张铺片随机选择5个视野，在放大400倍显微镜下，计数1 000个细胞中的阳性细胞数，并计算阳性细胞率。

     统计学处理：以SPSS 10.0统计软件对结果做统计学处理，用t检验对各组进行比较。

    2结果

    2.1 Bcl-2蛋白表达特征  空白对照组Bcl-2蛋白表达位于细胞质内，呈棕黄色颗粒，细胞核呈兰色。阴性细胞细胞质不着色，仅见细胞核被染成兰色。在空白对照组晶状体上皮细胞中有较少表达,平均为（6.8±1.1）%，（图1）。EGb761在H2O2作用的早期(3h)并未引起实验组Bcl-2蛋白表达明显增加，其后随着时间的延长，实验组Bcl-2蛋白表达逐渐增加(图1，2)。对照组在H2O2作用的早期表现出Bcl-2蛋白表达增加的趋势，随后明显下降(图1，3)。

     2.2 Bax蛋白表达特征  空白对照组Bax蛋白表达位于细胞质内，呈棕黄色颗粒，细胞核呈兰色。阴性细胞细胞质不着色，仅见细胞核被染成兰色。空白对照组晶状体上皮细胞中表达极少或未见表达，平均为（4.6±0.8）%(图2)。EGb761作用于H2O2处理的实验组，在24h内，Bax蛋白表达未见明显变化，对照组随着培养时间的延长，Bax蛋白表达显著增加(图4，5)。

    3讨论

     原癌基因bcl- 2是抑制细胞凋亡(apoptosis)途径中的一个重要基因，bcl-2通过抗氧化的途径阻止细胞发生凋亡[2-6]。bcl- 2能对抗H2O2诱导的细胞液钙浓度升高和继发的谷胱苷肽还原系统功能损害而引起的细胞死亡[7-9]。已经发现抗氧化剂如坏血酸能通过增加bcl-2表达而减少细胞凋亡的发生，但氧化应激诱导剂引起细胞增殖或凋亡与bcl-2功能关系尚未完全明了[10]。我们的实验结果显示：对照组在H2O2作用的早期Bcl-2蛋白表达增加，是否晶状体上皮细胞自身抗氧化防御机制对氧化应激的反应，有待进一步实验证实。bax 基因与bcl-2基因有21%的同源性，bax具有促进细胞凋亡发生的作用，氧化应激诱导Bax表达增加，并通过使Bcl-2 水平下降，引起继之而发生的细胞凋亡。Bax可与Bcl-2形成同源或异源二聚体，细胞内Bax和Bcl-2的量决定了Bcl-2/Bax和Bax/Bax二聚体的比例，而这一比例又决定了细胞对凋亡信号的易感性，调节细胞死亡和存活的平衡状态[11]。已有实验证实，机体的抗氧化防御机制如谷胱苷肽还原系统能力的提高可减少bax表达所引起的细胞凋亡的发生，可知氧化还原的动态平衡在维持细胞生存中起着必不可少的重要作用[12]。在我们的实验中发现，对照组在H2O2作用的早期引起Bcl-2蛋白表达增加，随后出现Bcl-2表达明显下降，Bax表达显著增加以及Bcl-2 /Bax比例下降，可能与对照组晶状体上皮细胞凋亡率高于实验组有关。

     我们的实验结果显示，EGb761作用于H2O2处理的晶状体上皮细胞，在作用的早期(培养3h)并未引起显著的Bcl-2表达增加，据此可推测EGb761启动或提高晶状体上皮细胞自身的抗氧化防御机制保护细胞免受氧化损伤先于引起Bcl-2表达增加。EGb761可能减轻了H2O2对晶状体上皮细胞的氧化应激作用，维持了晶状体上皮细胞在高H2O2环境中氧化还原的动态平衡。虽然在整个培养期中Bax表达无明显变化，但随着培养时间的延长，实验组Bcl-2表达阳性细胞率逐渐增加，Bcl-2 /Bax比例逐渐提高，即EGb761通过提高Bcl-2表达而非降低Bax表达水平，表现出抗氧化损伤所致的细胞凋亡。与报道相一致[11]。而过氧化氢处理对照组在H2O2作用的早期引起Bcl-2表达增加，随后出现Bcl-2表达明显下降，Bax表达显著增加以及Bcl-2 /Bax比例下降，并由此而致细胞凋亡的发生。而Bax与氧化应激在白内障发生中的确切关系有待进一步研究。

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