高效液相色谱法测定小败毒膏中咖啡酸的含量

             作者：赵艳波 李春来 孙冬梅

【摘要】  目的：建立小败毒膏的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱：Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm, 5μm，流动相：甲醇-0.01mol·L-1磷酸二氢钠溶液（23：77），流速：0.8ml·min-1，检测波长：323nm，柱温：40℃。结果：咖啡酸在1.00～40.00μg范围内线性关系良好（r=0.999 6）；平均加样回收率为97.8%， RSD=1.3%（n=6）。结论：该方法简便易行，结果准确可靠，可适用于小败毒膏的质量控制。

【关键词】  高效液相色谱法 小败毒膏 咖啡酸 含量测定

    Determination of Paeonol content in Xiaobaidu electuaryby HPLC

    【Abstract objective】To set up a method for quality control of Xiaobaidu electuary. Method: HPLC method was developed to quantitative determination. COLUMN Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm, 5μm. The mobile phase was methanol-0.01mol·L-1 sodium dihydrogen phosphate (23:77).The column temperature was 40℃, the wavelength for detection was 323nm, flow rate was 0.8ml·min-1. Result: The paeonol average of recovery rate was 97.8%, and RSD was 1.3% (n=6). Conclusion: The method is simple, accurate and suitable for its assaying.

    【Key words】 Xiaobaidu electuary ； Caffeic acid； Determination

    小败毒膏为《卫生部药品标准》第八册（中药成方制剂）收载的品种，由蒲公英、金银花、天花粉、当归、黄柏、赤芍等16味中药组成，具有清热解毒，消肿止痛之功效。临床用于湿热蕴结、热毒雍盛引起的疮疡初起，红肿硬痛，风湿疙瘩，周身刺痒，乳痈涨痛，大便燥结 [1]，疗效良好。处方中蒲公英为主药，咖啡酸为其主要有效成分，为了更好地控制制剂的内在质量，本文采用高效液相色谱法测定小败毒膏中咖啡酸的含量，以其为该制剂的质量提供快速、准确的测定方法，现报告如下。

    1  仪器与试药

    LC－2010A 高效液相色谱仪，CLASS－VP 色谱工作站；咖啡酸对照品（批号：885-200001），由药品生物制品检定所提供，供含量测定用；小败毒膏为市售样品（药都制药集团股份有限公司，批号：061011，061105，061107）。甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件

    色谱柱：Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm, 5μm；流动相：甲醇-0.01mol·L-1磷酸二氢钠溶液（23：77）；检测波长：323nm；流速：0.8ml·min-1；柱温：40℃。

    2.2  溶液制备

    2.2.1  对照品溶液的制备  精密称取在110℃干燥至恒重的咖啡酸对照品适量，加甲醇制成0.100 0mg·ml-1的对照品贮备液；再精密量取对照品贮备液适量，加甲醇制成20.00μg·ml-1的对照品溶液，即得。

    2.2.2  供试品溶液的制备  取约2g，精密称定，置烧杯中，加水3ml，置水浴温热并搅拌使溶散，加硅藻土2g，拌匀，置100℃烘箱中，烘干，转移至50ml具塞锥形瓶中，并用水3ml洗涤烧杯及玻棒，洗液并入锥形瓶中，置100℃烘箱中，烘干，精密加5%甲酸的甲醇溶液10ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用5%甲酸的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，即得[2]。

    2.2.3  阴性对照溶液的制备  取除蒲公英以外的处方中其余药材的十分之一量，按法制成膏剂，再按供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。

    2.3 专属性试验

    分别精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图（图1）。由图1可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间（咖啡酸10.169 min）的色谱峰，阴性试验无干扰，证明本法可行。

    2.4  线性关系考察

    精密吸取咖啡酸对照品贮备液（浓度：0.100 0mg·ml-1）适量，分别置于10ml量瓶中，加甲醇定容，配成浓度分别为1.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00μg·ml-1的溶液6份，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤。精密吸取续滤液各10μl，注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，其浓度（C）为横坐标，经线性回归得回归方程为：A=2.58×108 C-3.29×104，r =0.999 6（n=6），结果表明，咖啡酸在1.00～40.00μg·ml-1范围内峰面积与其浓度呈良好线性关系。

    2.5  精密度和稳定性试验

    精密吸取咖啡酸对照品溶液（20.00μg·ml-1）10μl，在上述色谱条件下重复进样5次，求得咖啡酸溶液峰面积的RSD为0.5%，表明精密度较好。取同一供试品溶液，在0、4、8、12、24h分别进行测定，结果表明咖啡酸对照品溶液在24h内稳定，RSD为0.7%（n=5）。

    2.6  重复性试验

    取供试品（批号061011），共5份，分别按“2.2.2供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，进行测定，求得咖啡酸含量的RSD为1.1%，表明重复性较好。

    2.7  加样回收率试验

    精密称取已知含量的样品（批号061011，咖啡酸含量68.10μg·g-1）适量，共6份，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入咖啡酸对照品贮备液（0.100 0mg·ml-1）各1ml，按“2.2.2供试品溶液的制备”方法操作，得回收率试验溶液，依法测定，结果见表1。

    2.8  样品含量测定

    分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定3批样品中咖啡酸峰面积，按外标法其含量（n=5），结果见表2。 表1     咖啡酸加样回收率试验表2     3批样品含量测定结果

    3  讨论

    3.1  通过对3批样品中咖啡酸的测定，结果表明最高含量为72.85μg·g-1 ，最低为66.23μg·g-1，综合考虑确定限量每克含咖啡酸不得低于40μg。

    3.2  流动相的选择 试验中采用不同的流动相甲醇-0.01mol·L-1磷酸二氢钠溶液（23：77）（pH3.8～4.0），甲醇-0.01mol·L-1磷酸二氢钠溶液（25：75）（pH3.8～4.0），结果表明采用流动相甲醇-0.01mol·L-1磷酸二氢钠溶液（23：77）的色谱图基线较稳[2]。

    3.3  本方法结果准确，方法简便，重现性及回收率均理想，可以作为该制剂的质量控制方法。

【】
  [1] 卫生部药品标准中药成方制剂[S]．第八册．1993，29．

[2] 药典[S]．2005年版．一部．244～245．