Syk与C-erbB-2、PCNA在乳腺癌中的表达及意义
作者：王树峰 问明 郑宝恒 底旺 李艳玉
【摘要】 ［目的］ 通过检测Syk与C-erbB-2、PCNA在乳腺癌中的表达，分析Syk表达与临床预后指标的关系，探讨Syk在乳腺癌预后评价中的意义。［方法］ 应用免疫组化法检测5例乳腺纤维腺瘤、5例正常乳腺标本和35例乳腺癌手术标本中Syk和C-erbB-2、PCNA的表达水平。［结果］ 正常乳腺标本及乳腺纤维腺瘤标本中C-erbB-2及PCNA均为阴性而Syk全部呈阳性。35例乳腺癌中Syk（-）11例，C-erbB-2（+）18例， PCNA（+）24例，Syk的表达与PCNA表达相关，但与C-erbB-2表达无明显相关。［结论］Syk表达缺失可作为判断乳腺癌预后的指标。
【关键词】 乳腺肿瘤 Syk C-erbB-2 增殖细胞核抗原 免疫组织化学
The Expression and Significance of Syk and C-erbB-2，PCNA in Patients with Breast Cancer
Abstract:［Purpose］To investigatethe expression of Syk and C-erbB-2，PCNA in patients with breast cancer , and to analyzethe relationship between Syk expression and prognosis predictors，thento elucidate the value of expression in breast cancer prognosis and treatment. ［Methods］ The expression of Syk, C-erbB-2 and PCNA were examined by immunohistochemistry in 5 specimens of normal breast tissue, 5 specimens of breast fibroadenomas and 35 specimens of breast cancer. ［Results］In breast fibroadenomas and normal breast tissue, the C-erbB-2 and PCNA were negatively expressed in all specimens, while Syk was positively expressed in all specimens. In the 35 breast cancer specimens，Syk（-）11，C-erbB-2（+）18， PCNA（+）24. There was significant correlation between the expression of Syk and PCNA, but there wasn’t significant correlation between the expression of Syk and C-erbB-2. ［Conclusions］The negative expression of Syk could be considered as a prognostic predictor for breast cancer.
Key words: breast neoplasms；C-erbB-2；PCNA；Syk； immunohistochemistry
本研究欲通过免疫组织化学SP法检测乳腺癌组织中C-erbB-2、PCNA和Syk的表达情况，并结合临床和病理参数以及对术后患者的随访观察结果，探讨它们之间的关系，并着重探讨Syk表达在乳腺癌预后判断中的意义以及它在临床应用中的价值。
1 材料与方法
1．1 临床资料
5例乳腺纤维腺瘤标本以及5例正常乳腺组织标本，均选自本院门诊手术室，35例乳腺癌组织标本均选自本院1992年12月至1997年12月存档的手术切除组织标本蜡块，所有标本均经过病理检查证实为原发性乳腺癌。患者全部为女性，年龄20岁~68岁，平均年龄44.74岁。所有病例术前未进行过放疗及化疗，也未进行过腋窝淋巴结活检手术以及腋窝的其他手术；均行乳腺癌根治或改良根治手术切除的标本。其中，非浸润性乳腺癌10例，均为导管内癌，浸润性乳腺癌25例，包括单纯癌14例、导管浸润癌8例、髓样癌2例以及黏液腺癌1例。高度分化2例、中度分化17例、低度分化16例。35例乳腺癌标本中有腋窝淋巴结转移19例，无腋窝淋巴结转移16例，并均经病理组织学检查确诊。随访至2002年12月底，5年内死亡9例。
1.2 免疫组化染色
石蜡切片常规酒精脱蜡至水，3%甲醇双氧水封闭内源性过氧化物酶，将切片完全浸泡于0.01mol 枸橼酸盐缓冲液中，放入微波炉内进行抗原修复，在切片组织标本上滴加5%正常山羊血清以封闭游离结合位点，减少非特异性染色，置于湿盒中室温条件下孵育30min。倾去山羊血清，于组织切片上滴加一抗（C-erbB-2、PCNA均为工作液， Syk为pH 7.4的0.01mol PBS缓冲液1∶90比例稀释），置于湿盒中4℃冰箱内过夜。于组织切片上滴加生物素标记的二抗，置于湿盒中室温条件下孵育30min。于组织切片上滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液（三抗），置于湿盒中室温条件下孵育30min。DAB显色，滴加苏木精复染细胞核2min，清水充分冲洗。中性树胶封片。显微镜下观察。采用已知的阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照，以排除假阳性结果。
1.3 结果判定
通过光学显微镜观察分析，在高倍视野（×400）下对含棕黄色颗粒的细胞进行计数，阳性细胞所占百分比。
以定位明确，染色明显者为阳性，而染色弱或完全不染色者为阴性。阳性细胞≤10%为（-），10%~25%为（+），25%~50%为（++），≥50%为（+++）。将（++）以下的记为阴性标本，（++）及（+++）记为阳性标本。
1.4 统计学分析
求出各组的阳性比率，组间比较采用计数资料的精确概率法进行统计学分析。
2 结 果
2.1 Syk、C-erbB-2及PCNA在乳腺组织中的表达
正常乳腺标本及乳腺纤维腺瘤标本中C-erbB-2及PCNA均为阴性表达，而Syk则全部呈阳性。
在35例原发性乳腺癌组织标本中，C-erbB-2主要表达于乳腺癌细胞的细胞浆中，阳性产物为棕黄色颗粒，其中阳性表达18例，阳性率为51.4%（18/35）；PCNA主要表达于乳腺癌细胞的细胞核，阳性产物为棕黄色颗粒，其中阳性表达24例，阳性率为68.6%（24/35）；而Syk主要表达于乳腺组织的细胞浆中，阳性产物为棕黄色颗粒，其中表达缺失11例，阴性率为31.4%(11/35)。
经统计学分析，Syk与PCNA表达之间存在密切的关系（P<0.05），而未发现Syk与C-erbB-2表达之间有明显关系(P>0.05)。
2.2 Syk、C-erbB-2及PCNA表达与预后
35例乳腺癌患者术后5年内死亡9例，占25.7%（9/35），生存5年以上者则占74.3%（26/35）。生存5年以下的9例中Syk（-）6例，占66.7%（6/9），生存5年以上的26例中Syk（-）5例，占19.2%（5/26），两者比较差异有显著性（P<0.05）(见表1)。生存5年以下的9例中C-erbB-2（+）8例，占88.9%（8/9），生存5年以上的26例中C-erbB-2（+）10例，占38.5%（10/26），两者比较差异有显著性（P<0.05）(见表1)；生存5年以下的9例中PCNA（+）9例，占100%（9/9），生存5年以上的26例中PCNA（+）15例，占57.7%（15/26），两者比较差异有显著性（P<0.05）(见表1)；可见C-erbB-2、PCNA阳性表达与乳腺癌患者的5年生存率降低关系密切，而Syk阴性表达与乳腺癌患者的5年生存率降低关系密切。
2.3 Syk表达与临床病理特征的关系
35例乳腺癌标本中，浸润性乳腺癌的25例标本中Syk（-）11例，占44%（11/25），而为非浸润性乳腺癌的10例标本中无Syk（-）情况，两者比较差异有显著性（P<0.05）（见表2）。
乳腺癌中Sky表达与临床病理特征关系见表2，显示Sky阴性表达与淋巴结转移、侵袭性、细胞分化程度有显著性相关，而与临床分期、肿瘤大小及月经状态无显著性相关。
3 讨 论
随着细胞生物学、分子生物学的不断，人们发现许多癌基因编码产物具有酪氨酸激酶的活性，与肿瘤的发生关系密切。Syk(spleen tyrosine kinase)编码基因为SYK，位于人染色体9q22，蛋白分子量为72kD，全长629个氨基酸，属于非受体型蛋白酪氨酸激酶，是B细胞激活信号转导过程中最重要的激酶，并被作为B细胞受体（BCR）信号转导分子得到广泛的研究。Syk与T细胞激活中的ZAP-70属于同一蛋白酪氨酸激酶家族，其特点是除了有激酶活性中心SH1之外还有两个SH2结构域，因而成为磷酸化ITAM招募的首选对象。被招募的Syk立即成为Src作用的第二个靶目标，进而可以启动B细胞活化信号转导的三条主要途径，最终激活各种转录因子，使之进入细胞核内，进而使相应的基因发生转录激活出现产物的表达。
近来，研究认为Syk在多种恶性肿瘤的发病过程中起着极为重要的作用。Martin等[11]研究认为乳腺腺体发育主要是在成年期，此时的乳腺组织不断地进行生长、分化、退化的循环，并受到生长因子、激素、细胞与细胞以及细胞与母体之间相互作用的综合控制，而酪氨酸激酶在这一系列控制细胞增长和细胞内信号转导方面的作用发生在上游启始阶段，从而提出Syk不仅与乳腺癌的发生发展密切相关，而且还是乳腺肿瘤形成中的早期因子。
本实验研究显示，Syk主要表达于正常乳腺上皮细胞的细胞浆，在乳腺癌细胞中表达缺失，其表达情况与乳腺癌的侵袭性、肿瘤细胞的分化程度、腋窝淋巴结状态、5年生存率等均有密切的关系，可见Syk的表达情况对于判断乳腺癌肿瘤细胞的分化情况，是否存在转移以及术后5年生存情况均有重要意义。
PCNA 是真核细胞DNA合成所必需的一种36kD的非组织核酸蛋白，合成于晚G1期和S期，在DNA复制过程中有调节作用，因为仅在增殖期细胞中合成和表达，故被视为评估肿瘤细胞增殖活性的一个标记物。35例乳腺癌标本中PCNA表达率为68.6%，与Goel等[1]报道的71.4%接近。我们同时发现PCNA表达情况与5年生存率之间有密切的关系，PCNA高表达的乳腺癌患者的5年生存率明显低于PCNA低表达者，提示PCNA 能够很好地反映肿瘤细胞的增殖活性，对于肿瘤的诊断以及预后判断有一定的意义，与已知相关研究资料[2]相符。
乳腺癌标本中PCNA表达情况与Syk表达之间有着密切关系（P<0.05），Syk表达缺失的乳腺癌病例中可以见到PCNA表达增高。然而，因为目前此方面研究报道尚少，故此结果未能参照比较，但是鉴于PCNA是肿瘤组织中细胞增殖活性的标志因子，提示Syk对于肿瘤细胞的生长具有抑制作用，但是，其两者之间确切的关系仍有待于扩大样本例数，进一步研究证实。
Carter等[3]研究认为Syk与HER2/neu是一对功能相反的抑癌/癌基因。HER2/neu过度表达可以诱导血管内皮细胞收缩，从而使肿瘤细胞易于穿过血管屏障，易于发生转移；而Syk可以抑制HER2/neu的收缩血管内皮细胞的作用，从而抑制肿瘤的转移[4]。本研究通过对35例乳腺癌组织标本中Syk与C-erbB-2表达情况的研究，未能发现两者在表达方面有关，与Yun fei等[5]研究结果一致，因此这两个指标在表达上是否有关以及存在何种相关关系还有待于扩大观察样本数进一步研究。
总之，本研究结果表明，Syk表达的缺失与乳腺癌的发生、转移存在密切的关系，Syk是强有力的乳腺癌肿瘤抑制因子。虽然，目前关于Syk还有很多问题尚未研究清楚，但对Syk的进一步深入的研究对于乳腺癌的早期发现、准确判断预后以及积极都具有十分有意义。
【】
[1]Goel MM, Goel R, Mehrotra A, et al. Immunohistochemical localization and correlation of p53 and PCNA expression in breast cancinoma[J]. Indian J Exp Biol，2000，38(3)：225-228.
[2]Patric L，Fitzgibbons MD，David L，et al. Prognostic factor in breast carcinoma[J]. Arch Pathol Lab Med，2000，124：966-978.
[3]Carter W， Hoying J，Boswell C，et al. HER2/neu over-expression induces endothelial cell retraction[J]. Int J Cancer，2001，91(3)：295-299.
[4]Stewart Z, Pietenpol J. Syk a new player in the field of breast cancer[J]. Pancrease Cancer Res，2001，3(1)：5-7.
[5]Baylin SB, Herman JG. DNA by permethylation in tumorigenesis,epigenetics joins genetics[J]. Trends Genet，2000，16：168-174.
