青蒿琥酯诱导HL?60细胞凋亡的研究
作者：刘俊玲，虞荣喜，陈均法
【摘要】 本研究旨在研究青蒿琥酯体外诱导HL?60细胞凋亡及其过程中Bcl?2与ICAD蛋白表达的变化。采用MTT法测定青蒿琥酯对HL?60细胞的生长抑制作用；用光学显微镜检、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术观察和检测青蒿琥酯诱导HL?60细胞的凋亡；应用蛋白印迹法检测青蒿琥酯诱导HL?60细胞凋亡过程中Bcl?2与ICAD的表达变化情况。结果表明：青蒿琥酯对HL?60细胞有明显的生长抑制作用，并呈时间、剂量依赖性。48小时IC50值为18.33 μg/ml，其增殖抑制作用与诱导细胞凋亡有关；Bcl?2和ICAD在HL?60细胞中均有表达，且随药物浓度的增高表达量逐渐降低。结论：青蒿琥酯可诱导HL?60细胞凋亡，Bcl?2和ICAD在青蒿琥酯诱导HL?60细胞凋亡的信号传导途径中可能是重要的调控因子。
【关键词】 青蒿琥酯 HL?60细胞系 细胞凋亡
Apoptosis of HL?60 Cells Induced by Artesunate In Vitro
Abstract The study was aimed to investigate the effect of artesunate (ART) on the apoptosis of HL?60 cells in vitro and the expression of Bcl?2 and ICAD in the process of apoptosis induced by ART. The inhibition of ART on HL?60 cells were evaluated by means of MTT assay; cell apoptosis was detected by light microscopy, agarose gel electro?phoresis, flow cytometry; Western blot was used to analyze the expression of Bcl?2 and ICAD in cells during apoptosis induced by ART. The results showed that ART could significantly inhibit the proliferation of HL?60 cells in time?and dose?dependent manner. After treating HL?60 cells with ART for 48 hours, the IC50 values was 18.33μg/ml and its inhibition effect contributed to the induced apoptosis. Bcl?2 and ICAD proteins both all expressed in HL?60 cells, the level of expression declined as concentration increased. It is concluded that artesunate may induce apoptosis of HL?60 cells in vitro, Bcl?2 and ICAD may be an important control factor in the signal transduction pathway of ART?induced apoptosis.
Key words artesunate; HL?60 cell line; apoptosis
青蒿琥酯（artesunate，ART），是具有倍半萜内酯类抗疟药青蒿素的衍生物，其除具有高效抗疟作用外，对多种肿瘤细胞均有诱导凋亡作用［1，2］。本研究观察了青蒿琥酯对HL?60细胞的凋亡诱导作用及凋亡过程中bcl?2和ICAD的表达情况，以便为青蒿琥酯作为抗白血病药物应用于临床提供理论基础。
材料和方法
药物和试剂
注射用青蒿琥酯为桂林南药股份有限公司产品，批号 041101，5%碳酸氢钠1 ml溶解后，用RPMI 1640配制所需浓度；碘化丙啶（PI）、噻唑蓝（MTT）为Sigma公司产品；细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司；bcl?2和ICAD单克隆抗体均为美国Santa Cruz公司产品。
细胞系及细胞培养
急性早幼粒细胞白血病细胞株HL?60由浙江大学医学院附属第二肿瘤研究所提供。细胞按常规悬浮细胞培养法培养于含10%热灭活小牛血清的RPMI 1640培养液中，置37℃、5% CO2培养箱中培养。每2-3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。
MTT测定
取对数生长期细胞，调整细胞浓度至1×105/ml，接种于96孔板，每孔100 μl，青蒿琥酯终浓度分别为1、2、4、8、16、32、64及128 μg/ml，每孔100 μl，设空白对照组。药物分别作用24、48、72小时后，每孔加MTT 20 μl，于37℃、5% CO2培养箱中培养4小时，离心弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，振荡摇匀，在570 nm酶标仪上测吸光度值（A570），抑制率，求半数抑制浓度IC50。
细胞抑制率（%）=（A对照－A实验/A对照）×100%
细胞经对照组、给药组作用48小时后，收集细胞，经磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗2遍后，细胞制片机离心、制片，Wright?Giemsa染色，油镜下观察细胞形态变化。
细胞DNA提取及片段化分析
取对数生长期细胞，调整浓度为1×105/ml，加入青蒿琥酯8、16、32 μg/ml，共同培养48小时，收集各组细胞，用PBS洗2次，裂解细胞，提取细胞DNA，将其溶于20 μl TE缓冲液中，取5 μl加入含EB的1%的琼脂糖凝胶，于50 V恒压下电泳约1小时，凝胶自动成像系统拍照。
细胞凋亡的流式细胞术检测
收集空白对照组及各药物组细胞，用PBS洗2次，用70%冷乙醇4℃固定24小时以上，再用PBS冲洗1次，调细胞终浓度至1×106/ml，加入10 mg/ml的RNase 50 μl，室温放置30分钟。再加50 μg/ml的碘化丙锭（PI）800 μl，4℃避光染色10分钟，用流式细胞仪检测，所有资料经Multicycle2.50 DNA分析软件处理。
Bcl?2和ICAD表达的Western blot分析
分别收集空白对照组及各药物组细胞约1×107，用PBS洗2次，离心弃去上清，加入蛋白提取液（细胞裂解液：50 mmol/L HEPES， pH 7.0, 250 mmol/L Nacl, 0.1% NP?40, 5 mmol/L EDTA）, 蛋白酶抑制剂与细胞裂解液之比为1∶9，置于冰上裂解20分钟，稍振荡，4℃ 10 000 rpm离心15分钟，收集上清。用5×SDS上样缓冲液变性蛋白，煮沸后以10 μg蛋白／泳道等量上样，12% SDS?PAGE经80 V电泳分离至分离胶后，120 V电泳分离不同分子量蛋白，以湿式转膜法在4℃，250 mA，2小时将其转移至PVDF膜。取出膜并将与胶接触面朝上置于5%的脱脂奶粉（pH 7.4的TBST配制）室温下轻轻摇动封闭2小时。分别加入一抗，分别是鼠抗人Bcl?2浓度为1∶200，鼠抗人ICAD浓度为1∶100，兔多抗Beta?actin浓度1∶1 000为一抗（5%的脱脂奶粉，pH 7.4的TBST配制）及1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、羊抗兔Beta?actin二抗（5%的脱脂奶粉，pH 7.4的TBST配制），显色，在暗室内曝光摄片。以β?actin作为内参照。
统计学分析
数据用均数±标准差（±SD）表示，三组间数据比较用单因素方差分析q检验，检验以P<0.05或P<0.01为差异显著的标准。采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。所有实验结果均重复3次。
结 果
青蒿琥酯对于HL?60细胞的增殖抑制作用
不同浓度青蒿琥酯作用于HL?60细胞24、48、72小时后的抑制率与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.01）（表1），青蒿琥酯对HL?60细胞的增殖抑制作用呈明显的时间剂量依赖性，24、48、72小时的IC50分别为 52.61、18.33、0.81 μg/ml。
HL?60细胞的形态学观察
16 μg/ml青蒿琥酯作用于HL?60细胞48小时后，细胞形态发生了明显改变。染色质分布不均，呈致密浓染的块状，核膜增厚，核固缩；而未加药物组，细胞体积大，外形较规则，核呈圆形或椭圆形，核染色质疏松细致，呈蓝紫色，核仁大而清晰，胞浆丰富（图1）。Figure 1. Morphological changes of HL?60 cells induced by ART under light microscope. A: cells induced by ART at 16 μg/ml for 48 hours. B: control (Wright′s?Giemsa staining. ×100).
细胞凋亡的DNA片段化分析
8、16和32 μg/ml青蒿琥酯作用于细胞48小时后，琼脂糖凝胶电泳呈现典型的梯状条带，而对照组DNA集中于加样孔附近。这表明青蒿琥酯可诱导HL?60细胞发生明显的DNA片段化，诱导细胞发生凋亡（图2）。
Figure 2. Nucleosomal DNA fragmentation of HL?60 cells induced by ART for 48 hours. M: marker. Lane 1: control group. Lane 2: 8 μg/ml group. Lane 3: 16 μg/ml group. Lane 4: 32 μg/ml group.
细胞凋亡的流式细胞术检测
DNA的PI染色结果显示：青蒿琥酯作用于HL?60细胞48小时后出现亚二倍体峰（即细胞凋亡峰），且亚二倍体峰所占比例随青蒿琥酯浓度的增加而增加。空白对照组及8、16和32 μg/ml浓度实验组的细胞凋亡率分别为6.40%、23.64%、54.45%和77.53%（图3）。
Bcl?2和ICAD蛋白的表达
Bcl?2和ICAD在HL?60细胞中均有表达，并且表达量较高。青蒿琥酯作用于细胞48小时后，随着药物浓度的增大，Bcl?2和ICAD两种蛋白的表达量逐渐降低（图4）。
讨 论
细胞凋亡是生物体内广泛存在的一种由细胞特定基因控制的细胞主动死亡过程，这一过程不仅存在于正常组织与器官，也存在于各种肿瘤组织，与肿瘤的发生、转归及抗肿瘤药物的有密切关系。细胞凋亡的检测包括形态学、生物化学、免疫化学、组织化学和分子生物学等方面。我们对青蒿琥酯诱导HL?60细胞凋亡进行了形态学、凋亡的定性定量、凋亡机制方面的研究。通过DNA电泳及流式细胞术检测，结果提示青蒿琥酯是通过诱导HL?60细胞凋亡而抑制其生长的。
bcl?2基因是血液系统恶性肿瘤中最为重要的拮抗凋亡的基因，主要位于核膜、粗面内质网和线粒体膜上［3］。bcl?2可能通过抑制Ca2+跨膜转运，抑制IL?1转化酶（该酶为蛋白水解酶）对膜脂质过氧化的保护作用，从而减少氧自由基的产生以诱导细胞凋亡［4］。在本研究中，青蒿琥酯作用HL?60细胞后，在8 μg/ml、16 μg/ml浓度下的Bcl?2蛋白的表达量与不加药物对照组的表达量相比有所降低，但差异不明显，而32 μg/ml青蒿琥酯作用细胞后Bcl?2蛋白的表达却明显下降。
ICAD/DFF55是CAD（caspase?activated deoxyribonuclease)的抑制蛋白，CAD可以造成凋亡时DNA的片段化。在正常细胞中CAD?ICAD以无活性的复合物存在，因而不处于激活状态［5］。细胞凋亡时，caspases水解ICAD，CAD即处于活性状态并最终使DNA片段化。有意义的是，CAD只在ICAD存在时才能合成并显示活性，因而ICAD对CAD的活化与抑制是必需的，即ICAD在细胞凋亡核事件中发挥着重要作用［6］。本研究中，Western blot分析结果显示：随青蒿琥酯浓度的增加ICAD的表达量逐渐降低。由此我们可以推测，Bcl?2与ICAD在青蒿琥酯诱导HL?60细胞凋亡的信号途径中可能是重要的调控因子，但青蒿琥酯诱导细胞凋亡的具体信号转导机制如何，还需进一步研究。
青蒿琥酯作为一种抗肿瘤的新药，能选择性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞且作用轻微，同时对多柔比星、长春新碱、甲氨碟呤或羟基脲无交叉耐药现象［7］；另外，青蒿琥酯通过抑制谷胱甘肽?S?转移酶的活性可以逆转肿瘤细胞对化疗药物的多药抗性［8］。因此，青蒿琥酯在白血病的临床治疗中有可能成为一种有前途的化疗药物。
【】
1Efferth T, Rucker G, Falkenberg M, et al. Detection of apoptosis in KG?la leukemic cells treated with investigational drugs. Arzneimittelforschung, 1996；46:196-200
2张星，杨小平，潘启超. 青蒿酯钠抗人肝癌 (BEL?7402) 与诱导凋亡. 中草药, 1998；29:467-469
3Thomas A, EL Rouby S, Reed JC, et al. Drug?induced appoptosis in B cell chronic lymphocytic leukemia: relationship between p53 gene mutation and bcl?2/bax proteins in drug resistance. Oncogene,1996；12:1055-1062
4费世杰，陈涛．调控白血病细胞凋亡相关基因的研究进展．中华实用中西医杂志，2003；3：1850-1852
5Peter ME, Heufelder AE, Hengartner MO. Advances in apoptosis research. Proc Natl Acad Sci USA,1997；94: 12736-12737
6Sakahira H,Enari ML, Nagata S. Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis. Nature ,1998；91(6662):96-99
7Efferth T, Dunstan H, Sauerbrey A, et al. The anti?malarial artesunate is also active against cancer. Int J Oncol, 2001；18:767-773
8Mukanganyama S, Widersten M, Naik YS, et al. Inhibition of glutathione stransferases by antimalarial drugs possible implications for circumventing anticancer drug resistance. Int J cancer, 2002；97:700-705??
