四嗪二甲酰胺诱导白血病细胞株SHI?1 凋亡及其分子机制研究
作者：周永列，吕亚萍，胡惟孝，邱莲女，王文松，刘建栋，吴建国
【摘要】 本研究探讨四嗪二甲酰胺（ZGDHu?1）诱导白血病细胞株SHI?1凋亡作用的机制。以不同浓度的ZGDHu?1在体外培养SHI?1细胞，用细胞形态学、DNA凝胶电泳、DNA含量及细胞周期分析、Annexin?V/PI双标记和Hoechst33258荧光染色等分析细胞凋亡。用Rh123/PI测定线粒体跨膜电位（ΔΨm），用流式细胞术检测ZGDHu?1诱导SHI?1细胞凋亡过程中bcl?2、bax、 p53、Fas蛋白和线粒体膜蛋白的表达变化。用RT?PCR观察经ZGDHu?1作用后SHI?1细胞bcl?2、bax、p53基因表达改变；同时利用实时荧光PCR定量检测端粒酶hTERT?mRNA表达的变化。结果表明：ZGDHu?1能诱导SHI?1细胞凋亡，呈作用时间和剂量的量效关系，出现典型的细胞形态改变，DNA片段化，亚G1峰检出并显著增加；Annexin?V/PI和Hoechst33258荧光染色后细胞发生凋亡的特征性改变。SHI?1细胞经不同浓度的ZGDHu?1体外培养后，bcl?2基因和蛋白有所下调，但主要是bax基因和蛋白上调，导致bax/bcl?2比值明显增高， p53基因和蛋白与Fas蛋白表达也上调，均呈剂量依赖性。随ZGDHu?1作用浓度的增加，ΔΨm下降，而线粒体膜蛋白表达显著升高，端粒酶hTERT?mRNA的表达显著下调。结论：ZGDHu?1通过上调p53基因、bax基因和bax/bcl?2比值，使线粒体跨膜电位显著下降的线粒体通路是ZGDHu?1诱导细胞凋亡的途径之一，Fas也参与其中，端粒酶有可能是其抗肿瘤的作用靶点。
【关键词】 四嗪二甲酰胺 细胞株 SHI?1 细胞凋亡 线粒体 端粒酶
Abstract The aim of study was to investigate the mechanism of N,N′?di?(m?methylphenyl)?3,6?dimethyl ?1,4?dihydro?1,2,4,5?tetrazine?1,4?dicarboamide(ZGDHu?1) inducing apoptosis in SHI?1 human leukemia cell line. Different concentrations of ZGDHu?1 and different times of culture were used to treat SHI?1 cells; the apoptosis of SHI?1 cells was analyzed by morphology, DNA agarose gel electrophoresis, DNA content detection, Annexin?V/PI and Hoechst33258 labeling method, the mitochondrial transmembrance potential（ΔΨm） were measured by dihydrorhodamin 123, and expressions of bcl?2, bax, Fas, p53 and mitochondrial membrane protein were analyzed by flow cytometry,while the bcl?2,bax and p53 gene were analyzed by RT?PCR. The transcriptional level of hTERT?mRNA was measured by real?time fluorescence quantitative RT?PCR. The results showed that after exposure to ZGDHu?1, SHI?1 cells were induced to apoptosis in a time?and does?dependent manner. SHI?1 cell apoposis was comfirmed by typical cell morphology, DNA fragmentation, sub?G1 phase, Hoechst33258 and Annexin?Ⅴ/PI labeling etc. The expression of bax, bax/bcl?2, p53 and Fas gene significantly increased and bcl?2 slightly decreased. ZGDHu?1 could increased the expression of mitochondrial membrane protein in a dose?dependent manner while ΔΨm reduced. The expression of hTERT?mRNA significantly decreased. It is concluded that ZGDHu?1 can up?regulate the expression of p53, bax and bax/bcl?2. The mitochondrial pathway mediated by descent of mitochondrial transmembrance potential may be one of the mechanisms inducing apoptosis by ZGDHu?1, in which Fas gene also participates. Telomerase may be an effective gene target for anti?tumour effect of ZGDHu?1.
Key words N,N＇?di?(m?methylphenyi)?3,6?dimethyl?1,4?dihydro?1,2,4,5?tetrazine?1,4?dicarboamide; cell line,SHI?1; apoptosis; mitochondria;telomerase
实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)四嗪二甲酰胺诱导白血病细胞株SHI?1凋亡的机制研究 四嗪二甲酰胺(ZGDHu?1)是一种新型的四嗪化合物，其化学名称为N,N＇?二（间甲苯基）?3，6?二甲基?1，4二氢?1，2，4，5?四嗪?1，4?二甲酰胺。胡惟孝等［1］以乙醛和水合肼为原料，改进了合成方法，合成中间体3，6?二甲基?1，6二氢?1，2，4，5?四嗪，获国家发明专利［2］。以此为先导化合物，设计并合成了多种经结构修饰的3，6?二甲基?1，4二氢?1，2，4，5?四嗪类化合物，从中筛选出ZGDHu?1具有较强的抗肿瘤活性。动物试验和体外实验表明，ZGDHu?1对乳腺癌MCF?7、肝癌BEL?7402、肺癌A549［3］和小鼠白血病P388等细胞株均有较强的抑制作用［4］，有望成为一种具有自主知识产权的抗癌新药。我们曾体外观察了ZGDHu?1对急性单核细胞白血病细胞株SHI?1的作用，发现ZGDHu?1对SHI?1细胞具有抑制增殖、诱导凋亡及诱导分化的作用［5］。但有关ZGDHu?1诱导肿瘤细胞凋亡的机制尚不清楚。为此，我们深入研究了ZGDHu?1诱导SHI?1细胞凋亡过程中有关调控基因的表达，探讨ZGDHu?1诱导SHI?1细胞凋亡的机制。
材料和方法
主要试剂
ZGDHU?1由浙江大学药学院制药工程研究所合成，系白色片状结晶。贮存液（1 mg/ml）用二甲亚砜溶解，应用液用含15%的小牛血清的IMDM（Gibco公司产品）配制。DNA?Prepkit(内含透膜剂，RNase和PI)为美国Beckman?Coulter公司产品； Annexin?Ⅴ和PI试剂系Bender MedSystems公司产品；PE标记bcl?2单克隆抗体（83?8B）系Becton Dickinson公司产品，bax单克隆抗体（4F11）、突变型P53单克隆抗体（PAB240）及用于bcl?2、bax检测的透膜剂（IntraprepTM Permeablization Reagent）及同型对照均系法国Immunotech公司产品。罗丹明123（Rhodamin 123）为Sigma公司产品，TRIzoL试剂购于Invitrogen公司。hTERT?mRNA实时荧光定量PCR试剂盒由Roche公司提供。
细胞培养
SHI?1细胞株由苏州大学附属第一、江苏省血液病研究所薛永权教授惠赠。该细胞株由研究所陈苏宁博士等［6］建自1例急性单核细胞白血病患者。SHI?1是1个伴有t（6；11）（q27;q23）和p53基因异常的裸小鼠高致瘤性单核细胞白血病细胞株，被证实对多种化疗药物耐药。采用含15%的小牛血清的IMDM，并加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）及青霉素（100 U/ml）和链霉素(100 μg/ml)的培养体系培养。培养环境为37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱。取对数生长期的细胞进行实验。
瑞氏?姬姆萨染色和Hoechst33258荧光染色
收集经ZGDHu?1作用后的SHI?1细胞，制成涂片，然后分别用瑞氏?姬姆萨染色和Hoechst33258荧光染色。Hoechst33258荧光染色方法为：先用固定液（甲醇∶冰醋酸3∶1）4℃固定5分钟，蒸馏水冲洗后加5 mg/L Hoechst33258染色10分钟，用蒸馏水洗片后经封片剂封片，尔后在荧光显微镜下观察。
DNA琼脂糖凝胶电泳
收获经ZGDHu?1作用的SHI?1细胞1×107个，用SDS和蛋白酶K裂解细胞后，按常规方法用酚?氯仿提取DNA，复溶于TE缓冲液中，经溴乙锭（0.5 μg/ml）染色后，用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，5 V/cm,电泳3-4小时，在紫外线透射仪上显影拍照。
Annexin V/PI标记
将不同浓度的ZGDHu?1与SHI?1细胞共同置37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱孵育，12、24小时后轻轻收获细胞1×106个，用冷PBS洗1遍后置0℃水浴中，加490 μl结合缓冲液，轻轻混匀细胞后加5 μl FITC?Annexin V和5 μl PI，10分钟后用流式细胞仪检测。
细胞SubG1检测
用不同浓度的ZGDHu?1作用SHI?1细胞不同时间后， 取细胞悬液检测细胞DNA倍体。具体方法为：取培养细胞悬液0.5 ml，用冷PBS各洗涤1次，加DNA?Prepkit中透膜液（内含Triton和 RNase）50 μl,轻摇后放置1分钟，加碘化丙锭（PI）染液500 μl作用15分钟后，在EPICS?XL型流式细胞仪（Beckman?Coluter产品）上分析，检测104以上个细胞，并用Muticycle 软件进行DNA倍体及细胞周期分析，亚二倍体峰 (subG1)的百分率。
凋亡相关调控基因蛋白的表达分析
收集经ZGDHu?1作用的细胞，用PBS洗涤1次后调整细胞悬液浓度为5×106/ml，供bcl?2,bax,p53及Fas测定。
bcl?2,bax检测 细胞悬液再用PBSF洗涤，每管加100 μl细胞悬液，加透膜剂I（固定剂）100 μl，室温放置15分钟后用PBSF洗一遍，再加透膜剂II（膜穿孔剂）100 μl，轻摇。5分钟后各管加bcl?2,bax单克隆抗体及同型对照20 μl，室温放置20分钟后用PBSF洗二次，加PE标记的第二抗体，室温暗处放置20分钟后用PBSF洗一次，将细胞悬于0.5 ml PBSF中。
p53检测 将细胞用冷甲醇固定后，用PBS洗涤1次，各加P53单克隆抗体及同型对照10 μl，室温放置30分钟，用PBS洗涤2次，加PE标记的第二抗体，室温暗处放置20分钟后用PBS洗涤1次，将细胞悬于0.5 ml PBS中。
Fas检测 取Fas单克隆抗体及同型对照各20 μl，各加细胞悬液100 μl，室温暗处放置30分钟，加PBS 0.5 ml。上述标记好的细胞，用流式细胞仪检测阳性细胞百分率。
线粒体膜蛋白和线粒体跨膜电位（ΔΨm）测定
线粒体膜蛋白检测 采用Koester等报道的预透膜的方法。各取100 μl细胞加于2支试管中，加100 μl洋地黄透膜剂（100 μg/ml）于冰浴中透膜20分钟，用PBS洗1遍，各加20 μl PE标记的线粒体膜蛋白单克隆抗体 APO2.7及同型对照，室温暗处放置30分钟后，用PBS洗1遍后将细胞悬液于1 ml含2.5%小牛血清的PBS中，用流式细胞仪检测。
ΔΨm测定 取药物作用后的细胞2×106，用PBS洗后，加10 μg/ml的RH123溶液，37℃孵育30分钟后，再加10 μg/ml的PI染色，5分钟后上流式细胞仪检测。
bcl?2、bax和p53 mRNA表达的半定量RT?PCR检测
总RNA提取 SHI?1细胞按1×105/ml，接种于25 m2培养瓶，每瓶5 ml。24小时后分别加入终浓度为10、100、500 ng/ml ZGDHu?1，并设不加药物的空白对照组。培养48小时后，收获细胞，按TRIzoL试剂盒说明书操作提取总RNA。
cDNA合成 取2 μg RNA，50 mmol/L oligo?dt 2 μl混匀，65℃水浴10分钟,立即置冰上，加入5×RT缓冲液5 μl,RNA酶抑制剂0.5 μl,M?MLV 1 μl,20 pmol/L dNTP 1 μl,用DEPC水补足25 μl反应体系，37℃水浴1小时，中止反应。
RT?PCR 以2 μl cDNA为模板，10×PCR缓冲液5 μl,25 mmol/L MgCl2 3 μl,1.5 μmol/L dNTP 2 μl,Taq DNA聚合酶1 μl,bcl?2,bax,P53，GAPDH正义链引物（分别为5′?CGACGACTTCTCCCGC CGCTACCGC?3′，5?TCCACCAAGAAGCTGAGCGA G?3′，5′?ATCTACTGGGACGGAACAGC?3′，5′?GTC GGTGTGAACGGATTT?3′）及反义链引物（分别为5′?CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC?3′，5′?GC TCAGCCCATGATGGTTCT?3′，5′?CTCTCGGAACA TCTCGAAGC?3′,5′?ACTCCACGACGTACTCAGC ?3′）各1 μl,用ddH2O补足反应体系50 μl。PCR条件：94℃预变性5分钟, 94℃变性30秒,60℃、56℃、65℃各退火30秒，72℃延伸30秒，扩增30个循环，72℃延伸10分钟。以GAPDH作为内参照。取PCR扩增产物15 μl，于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像分析仪观察并拍照，并读取每一待测基因与GAPDH的吸光度的比值。PCR的扩增长度为127 bp (bcl?2),253 bp (bax),242 bp (p53),276 bp (GAPDH)。
hTERT?mRNA表达的实时荧光定量RT?PCR检测
收集经ZGDHu?1作用的SHI?1细胞，以TRIzoL一步法按说明书提取各组细胞总RNA。检测时设加逆转录酶的测定管，不加逆转录酶的空白管和以PBGD为内参照的对照管，每批检测时同时测定hTERT?mRNR和PBGD的阴、阳性对照及标准曲线。PCR反应体系为20 μl，内含有10×反应缓冲液2 μl，逆转录酶0.1 μl，10×hTERT或PBGD反应测定应液2μl，PCR级蒸馏水13.9 μl，RNA提取物2 μl。按试剂盒说明书在Light Cycler荧光PCR仪上设置反应程序。结果以（测定管?空白管）/内对照管的比值表示。
结 果
ZGDHu?1诱导SHI?1细胞凋亡
细胞形态学观察 倒置显微镜下，空白对照组SHI?1细胞形态均一，可成簇生长。经ZGDHu?处理的SHI?1细胞皱缩变小，大小不一，出现细胞碎裂，未见细胞成簇生长 。经Wright?Giemsa染色后油镜下观察，细胞形态出现核固缩、核边聚、核碎裂，胞膜出泡，并可见典型的凋亡小体等。经Hoechst33258荧光染色后，在荧光显微镜下可见凋亡细胞的细胞核或细胞质内浓染致密的颗粒荧光，而正常细胞核呈弥漫均匀的荧光(图1)。
细胞SubG1检测 ZGDHu?1与SHI?1细胞培养24、48、72小时后，细胞周期及DNA倍体分析显示，细胞凋亡率与药物剂量和作用时间存在着显著的量效和时效关系。细胞周期进程明显受影响， G0/G1期细胞减少，细胞阻滞在G2/M期（表1），但随药物作用时间延长，G2/M细胞百分比显著减少；提示ZGDHu?1诱导G0/G1细胞凋亡并阻止细胞分裂。
DNA琼脂糖凝胶电泳检测 SHI?1细胞与不同浓度的ZGDHu?1孵育48小时后，经琼脂糖凝胶电泳，可见清晰的凋亡细胞特征性的梯状带。对照组无DNA梯状带出现（图2）。
凋亡细胞的Annexin V/PI双标记测定 用2-500 mg/ml的ZGDHu?1处理 SHI?1细胞后，经Annexin V/PI双标记测定， 12和24小时的早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）和细胞总凋亡率（Annexin V+/PI-与 Annexin V+/PI+之和）呈现时间、剂量依赖关系(图3,4)。
ZGDHu?1诱导SHI?1细胞凋亡的机制观察
bcl?2、bax、和p53 mRNA的表达 10、100、500 ng/ml 的ZGDHu?1与SHI细胞作用48小时后，bax mRNA的相对表达量(与内参照GAPDH的比值)随药物浓度升高而逐渐增加，比值分别为0.51、0.99、1.21，空白对照组为0.42；bcl?2 mRNA的相对表达量有下降趋势，分别为0.48、0.42、0.36,空白对照组为0.52；bax/bcl?2的比值为1.06、2.35、3.36,显著高于空白对照组的0.81；p53 mRNA的相对表达量分别为0.82、0.95、1.08,显著高于空白组0.21（图5）。
bcl?2、bax、p53和Fas基因的表达 SHI?1细胞经不同浓度(10、50、100、200、500、1000 ng/ml)的ZGDHu?1作用48小时后，bcl?2基因表达有下降趋势,更显著的是bax基因的表达显著增加，随药物浓度增加，bax/bcl?2的比值显著增高，呈现剂量依赖性。p53和Fas的表达也显著高于空白对照组，表现出药物剂量依赖型。与同一浓度ZGDHu?1作用SHI?1细胞24小时后检测结果相比较，前者bax、p53和Fas基因的表达高于后者，而bcl?2的表达则低于后者，表明ZGDHu?1作用SHI?1细胞后，bcl?2、bax、p53和Fas基因的表达变化具有时间?剂量依赖性（表2、图6）。
线粒体膜蛋白表达和线粒体ΔΨm 的变化 SHI?1细胞与ZGDHu?1培养24-48小时后，随ZGDHu?1浓度增高，线粒体膜蛋白表达增加，呈现一定的时间?剂量依赖性。Rh123是可被线粒体吸附的亲脂染料，能敏感反映线粒体ΔΨm 的变化，细胞内Rh123的摄取量（平均荧光强度的下降表示线粒体ΔΨm下降）。SHI?1细胞经ZGDHu?1作用24-48小时后，平均荧光强度显著下降，且表现出一定的作用时间和剂量依赖性(表3)。
hTERT?mRNA表达的变化 SHI?1细胞经不同浓度的ZGDHu?1培养48小时后，hTERT?mRNA表达水平逐渐下降，hTERT/PBGD的比值依次为104.3、77.8、62.3、53.6、33.8、32.9，空白对照为137.0。
讨 论
四嗪是一类四氮杂苯化合物，该类化合物一直不为人们所注意。目前唯一作为药品上市的替莫唑胺（temozolomide）是一种咪唑四嗪类口服抗肿瘤药，属于不对称四嗪类化合物。该药物对白血病、淋巴瘤及实体肿瘤尤其是脑部恶性肿瘤有较好的疗效。胡惟孝等［1］合成了另一类全新结构的对称四嗪化合物，经过大量的筛选和结构疗效学研究，发现ZGDHu?1具有显著的抗肿瘤活性。我们的前期研究发现ZGDHu?1可显著抑制SHI?1细胞增殖，其抑制效应呈时间和剂量依赖性。ZGDHu?1可使SHI?1细胞周期进程明显受影响，大部分细胞阻滞在G2/M期。50-500 ng/ml ZGDHu?1抑制SHI?1细胞增殖的同时，细胞形态出现典型的凋亡改变，DNA发生片段化，亚G1峰检出并显著增加，Annexin?V/PI和Hoechst33258荧光染色后显示凋亡细胞的特征性变化，证实ZGDHu?1能诱导SHI?1细胞凋亡。SHI?1细胞经2-50 ng/ml ZGDHu?1作用3天后，细胞发生部分分化，NBT阳性率增加，细胞表面CD11b、CD14、CD64表达上调，提示ZGDHu?1能诱导单核细胞白血病细胞株SHI?1细胞向成熟单核细胞分化［5］。同样，我们用ZGDHu?1作用于NB4和HL?60细胞，也发现ZGDHu?1在低浓度时可诱导细胞分化，在较高浓度时则可促使细胞凋亡［7］。
ZGDHu?1作用的分子机制尚不清楚。在细胞凋亡调控机制研究中，线粒体结构和功能障碍被认为是各种刺激因素诱导细胞凋亡的中心事件，并由此导致线粒体内凋亡诱发因子的释放，参与对细胞凋亡的调控。我们观察了ZGDHu?1诱导SHI?1细胞凋亡过程中线粒体膜蛋白表达和线粒体ΔΨm 的变化，发现反映线粒体膜通透性增加、结构改变的线粒体膜蛋白APO2.7的表达明显增加，呈现一定的时间?剂量依赖性，其表达变化与反映细胞凋亡的指标相平行。与此同时，线粒体ΔΨm显著下降，说明ZGDHu?1在诱导SHI?1细胞凋亡中，线粒体的结构发生了改变，膜通透性显著增加，使ΔΨm下降。ZGDHu?1通过作用线粒体途径使细胞发生凋亡。
bcl?2基因家族与线粒体调控细胞凋亡密切相关。该家族中抑凋亡基因bcl?2和促凋亡基因bax,bcl?xs,bad等主要分布在线粒体。bcl?2,bcl?xL定位在线粒体外膜称为PT孔的线粒体通透性转运孔道，而bax则散布在基质中，呈可溶性。它们相互竞争形成同源或异源二聚体，通过调控线粒体膜的变化，间接调控蛋白酶和核酸酶活性，双相调节细胞凋亡。外源性或内源性的刺激因子作用于细胞线粒体时，促凋亡的bax等基因家族可促进PT孔开放，释放细胞色素C，激活caspase级联反应，而抑凋亡的bcl?2基因可抑制PT孔的开放，bcl?2和bax的比例决定了细胞的增殖和凋亡［8］。本研究从基因和蛋白质表达的两个层面观察ZGDHu?1诱导SHI?1细胞凋亡过程中bcl?2和bax的表达变化。结果显示，ZGDHu?1作用后bcl?2基因和蛋白表达虽有一定程度下调，但更主要是bax基因和蛋白表达上调，导致bax/bcl?2比值明显增高，并呈时间?现剂量依赖性。
有作者研究替莫唑胺的作用机制时，认为替莫唑胺作用可能与DNA特定位置的甲基化有关。其中鸟嘌呤O6位置甲基化更为重要［9］，它诱导P53和P21waf?1 蛋白的表达，抑制细胞增殖并出现凋亡。本研究也从基因和蛋白质表达的两个角度，观察ZGDHu?1诱导SHI?1细胞凋亡过程中p53的表达变化，结果显示ZGDHu?1能上调p53的表达，提示P53途径也参与了ZGDHu?1诱导SHI?1细胞凋亡。
Fas和FasL系统是细胞凋亡中重要途径之一。Fas和FasL结合后形成同源三聚体，并通过细胞内不同的接头分子与效应分子结合，形成死亡起始复合体，启动细胞凋亡信号转导，从而导致细胞坏死。本研究结果显示，在ZGDHu?1诱导SHI?1细胞凋亡过程中，Fas表达随ZGDHu?1浓度增高和作用时间延长而增强，这说明Fas系统参与了ZGDHu?1诱导SHI?1细胞的凋亡过程。
近年来的许多研究，已经证实大多数的恶性肿瘤和白血病细胞高表达端粒酶活性［10］。因此，以端粒酶为靶点已成为抗肿瘤的研究热点。已有作者报道，替莫唑胺的抗肿瘤作用可能与抑制端粒酶活性有关［11］ 。现已知端粒酶有RNA模板hTR、逆转录酶hTERT和端粒酶相关蛋白1三种组分，其中hTERT作为端粒酶的催化亚单位，被认为是端粒酶的主要功能单位，与肿瘤细胞永生化的关系最密切。本研究用荧光实时定量RT?PCR检测了ZGDHu?1诱导SHI?1细胞凋亡过程中hTERT?mRNA的变化，发现随ZGDHu?1作用剂量增加、SHI?1细胞凋亡显著增加的同时，hTERT?mRNA的表达水平呈明显下降趋势，表现为剂量的负性量效关系。因此推测ZGDHu?1也可以通过抑制端粒酶活性使SHI?1细胞发生凋亡，从而认为端粒酶有可能是ZGDHu?1抗肿瘤的作用靶点之一。
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