酪氨酸激酶抑制剂逆转黏附诱导的骨髓瘤细胞的耐药性
作者：潘耀柱，陈协群，高广勋，顾宏涛，张永清，董宝侠，白庆咸，朱华峰
【摘要】 为了探讨酪氨酸激酶抑制剂STI571对RPMI8226细胞黏附、黏附诱导耐药以及靶细胞Rac1 mRNA表达的影响，本研究采用结晶紫染色法分析了RPMI8226细胞与纤连蛋白（fibronectin，FN）的黏附率，用MTT法检测瘤细胞的增殖性，并用半定量RT-PCR研究Rac1 mRNA水平的变化。结果显示：RPMI8226细胞与FN黏附1、6、12小时，其黏附率分别为(43.71±2.18)%、(55.63±1.56)%、(63.42±2.46)%；用20 μmol/L STI571处理1、6、12小时后黏附率分别降为(15.12±1.04)%、(17.58±1.32)%、(17.24±1.59)%；组间差异显著（P＜0.05）；阿霉素作用后，FN黏附组细胞IC50值［（1.46±0.04）μmol/L］显著高于BSA组［（0.78±0.03）μmol/L］(P＜0.05)；FN联合STI571组IC50值［(0.81±0.05)μmol/L］与BSA联合STI571组［（0.74±0.02）μmol/L］相比无显著性差异（P＞0.05），但却低于FN组(P＜0.05)；半定量RT-PCR显示，Rac1 mRNA水平在20 μmol/L STI571处理14小时后明显下降。结论：STI571能降低RPMI8226细胞与FN的黏附率、逆转黏附介导的阿霉素耐药，并且可以下调其Rac1 mRNA水平。
【关键词】 骨髓瘤细胞
Tyrosine Kinase Inhibitor Reverses Adriamycin Resistance Mediated by Cell Adhesion in RPMI8226 Cells
Abstract To study the effects of tyrosine-kinase inhibitor STI571 on the adhesion of RPMI8226 cells to fibronectin(FN)，cell adhesion mediated adriamycin-resistance and the Rac1 mRNA expression，the adhesion of RPMI8226 cells to fibronectin and drug resistance mediated by cell adhesion were determined by means of crystal violet staining and MTT assays respectively，Rac1 mRNA levels in RPMI8226 cells were examined by semi-quantitative RT-PCR.The results showed that STI571 could inhibit the adhesion of RPMI8226 cells to fibronectin.When RPMI8226 cells had been adhe-red to FN or BSA-coated wells for 1，6 and 12 hours，the adhesion rates were (43.71±2.18)%，(55.63±1.56)%，and (63.42±2.46)% respectively.After treatment with STI571 20 μmol/L，the adhesion rates decreased to (15.12±1.04)%，(17.58±1.32)% and (17.24±1.59)% respectively (P＜0.05).The experiment revealed that growth of RPMI8226 cells adhered to FN-coated plates had a significant advantage over growth on BSA-coated plates when exposed to adriamycin (Adr) for 1 hour followed by a 24-hour culture period，and the mean IC50 value for FN-adhered cells was (1.46±0.04) μmol/L while mean IC50 value for BSA control was (0.78±0.03)μmol/L (P＜0.05).Following treatment with 20 μmol/L STI571，the mean IC50 values for FN and BSA adhered cells were (0.81±0.05)μmol/L，(0.74±0.02)μmol/L respectively，there was no significant difference between them（P＞0.05）.RT-PCR demonstrated that the relative Rac1 mRNA level (Rac1/GAPDH) in RPMI8226 cells was downregulated following being treated with 20μmol/L STI571.It is concluded that STI571 can inhibit the adhesion of RPMI8226 cells to fibronectin，reverse cell adhesion mediated adriamycin-resistance，and downregulate Rac1 mRNA level.
Key words tyrosine-kinase inhibitor; STI571; myeloma cell; RPMI8226 cell; adhesion; drug resistance
多发性骨髓瘤（MM）至今之所以被认为是一种难以治愈的浆细胞恶性肿瘤，是因为瘤细胞最终会产生多药耐药，其中MM细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）间黏附在耐药中占有重要的地位，作为细胞与ECM之间作用的主要介导分子整合蛋白（integrin）与纤连蛋白（fibronectin，FN)结合对凋亡抑制、 细胞存活具有重要作用。 Damiano等［1］发现，经阿霉素（adriamycin，Adr）处理后，与FN黏附的骨髓瘤细胞比不黏附者具有明显的生长优势和较低的凋亡率，他们称这一现象为细胞黏附介导的耐药（cell adhesion mediated drug resistance，CAM-DR），采用封闭性抗体阻断整合蛋白与FN间的相互作用后，瘤细胞与FN间的黏附率明显下降，CAM-DR得以完全逆转。
肌动蛋白（actin）细胞骨架重构与细胞黏附密切相关，Abl酪氨酸激酶与RhoGTP酶Rac1是actin细胞骨架的重要调控分子。因此，Abl与Rac1极可能涉及MM细胞与细胞外基质(entracellular matrix，ECM)间的黏附过程以及靶细胞的CAM-DR形成。那么抑制Abl激酶活性能否逆转黏附诱导的MM细胞耐药呢？针对这一问题，我们以人骨髓瘤细胞株RPMI8226为研究对象，进一步探讨Abl激酶抑制剂STI571对MM细胞CAM-DR的逆转作用及其相关介导机理。
材料和方法
试剂
STI571由诺华制药公司惠赠，分子式为C29H31N7O·CH4SO3，分子量589.7。1粒胶囊含STI571 100 mg，用二甲亚砜（DMSO，Amrosco产品）充分溶解，离心去沉渣，以无菌注射用水稀释至1 mmol/L，分装，-20℃贮存。小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。四氮唑蓝（MTT）、结晶紫（crystal violet）、阿霉素均为Sigma产品。纤连蛋白为Becton Dickinson公司产品，注射用水溶解，分装，-20℃冻存。Taq酶购自大连TaKaRa公司；反转录试剂盒购Promega公司；RNA提取试剂TRIzoL购自Invitrogen公司；Rac1及内参照3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物均由上海Sangon公司合成。
细胞培养
多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞来源于ATCC，由第四军医大学病教研室惠赠。细胞培养于含100 ml/L灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置5% CO2、饱和湿度、37℃培养箱中悬浮培养，2-3天传代1次，实验用细胞处于指数生长期。
黏附实验
用无菌过滤的TSM buffer(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，2 mmol/L MgCl2，pH 8.0 )［2］分别配制50 μg/ml的FN及1% BSA，每孔50 μl包被96 孔板，4℃过夜，用 1% BSA封闭2小时。实验分为4组：①FN组：单纯用FN (50 μg/ml)包被；②对照组（BSA组）：单纯用1% BSA包被；③STI571+FN组；④STI571+BSA组。RPMI8226细胞经无血清RPMI 1640培养12小时，并以20 μmol/L 浓度的STI571(行细胞毒预实验测得)预孵育2小时后，按2.0×104细胞/孔，种入96孔板，每组平行3孔。37℃、5% CO2分别培养1、6、12小时（期间不去除STI571）。用RPMI 1640 培养液洗板3次，70%甲醇固定10分钟，洗板晾干。0.02%结晶紫染色10分钟［1］，PBS 洗去多余染料，再以0.2% Triton X-100溶解细胞，酶联免疫仪上测定各孔570 nm OD值，以含2.0×104细胞/孔为总OD值（100%）。细胞黏附率(%) =实验组OD值/总OD值×100%。
MTT检测
实验分4组，每组设3个复孔：①FN+Adr组；②BSA+Adr组；③STI571+Adr+FN组；④STI571+Adr+BSA组。FN包被及STI571处理同前。取指数生长期RPMI8226细胞按1.0×104细胞/孔种入96孔板，黏附12小时，每组分别加入以下浓度Adr：0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μmol/L，作用1小时，离心弃上清，加完全RPMI 1640液培养24小时后，加入MTT溶液（5 mg/ml）10 μl，37℃孵育4小时，每孔加入100 μl 10% SDS（含0.01 N HCl），充分溶解结晶物［3］，570 nm波长测定各孔OD值，实验重复3次，取平均值。生长抑制率(％)=(1-试验组A值/对照组A值)×100％。
RT-PCR检测
取指数生长期细胞分为20 μmol/L STI571处理组与空白对照组，1×106个细胞培养14小时后，采用TRIzoL试剂提取总RNA。RNA反转录按试剂盒说明书进行。将反转录产物cDNA于95℃变性5分钟，开始PCR的热循环：94℃变性40秒，51℃退火40秒，72℃延伸40秒，共28个循环，最后一个循环72℃延伸10分钟，4℃保存。Rac1及GAPDH引物设计参照［4］。Rac1上游引物为5′-AGG AAG AGA AAA TGC CTG-3′，下游引物为5′-AGC AAA GCG TAC AAA GGT-3′，产物长度为80 bp；GAPDH上游引物为5′-TCG GAG TCA ACG GAT TTG GTC GTA-3′，下游引物为5′-TGG CAT GGA CTG TGG TCA TGA GTC-3′，产物长度为525 bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统进行灰度值扫描，并以软件Genetools分析，以目的条带与内参照条带的比值（Rac1/GAPDH）代表目的基因mRNA相对水平。
统计学分析
应用SPSS 10.0处理数据，行T-test分析。
结果
STI571对RPMI8226细胞黏附的抑制作用
随着时间延长，RPMI8226细胞与FN的黏附率逐渐上升，1、6、12小时黏附率分别为(43.71±2.18)%、(55.63±1.56)%、(63.42±2.46)%；20 μmol/L STI571处理组1、6、12小时后黏附率分别降为(15.12±1.04)%、(17.58±1.32)%、(17.24±1.59)%；与对照组相比相差显著(P＜0.05)，表明STI571能显著降低RPMI8226细胞与FN的黏附（图1）。
STI571逆转RPMI8226细胞CAM-DR
经Adr作用后，BSA对照组RPMI8226细胞凋亡，并有良好的浓度依赖关系，其IC50为［（0.78±0.03）μmol/L］；靶细胞与FN黏附后Adr诱导的细胞凋亡明显减弱，其IC50［（1.46±0.04）μmol/L］显著高于BSA组(P＜0.05)，表明靶细胞黏附能提高其耐受Adr细胞毒作用，即产生了细胞耐药；而FN联合STI571处理组IC50［(0.81±0.05)μmol/L］，明显低于FN组(P＜0.05)，说明STI571能逆转骨髓瘤细胞因黏附介导的耐药；BSA联合STI571组IC50 ［（0.74±0.02）μmol/L］与BSA组［（0.78±0.03) μmol/L］相比无显著性差异（P＞0.05），说明STI571下调靶细胞IC50作用并非是由于STI571与Adr的协同作用所引起的（图2）。
STI571下调RPMI8226细胞Rac1 mRNA表达
Rac1 mRNA在RPMI8226细胞中高表达，其RP-PCR产物相对灰度值为1.65±0.15 (lane 1)，20 μmol/L STI571处理瘤细胞14小时后灰度值降为0.81±0.18(lane 2)，表明STI571能够下调靶细胞Rac1 mRNA 表达（图3）。
讨论
Abl属于非受体型蛋白酪氨酸激酶家族成员，大部分定位于核内，少部分在胞浆。其功能因Abl在细胞内定位不同而不同，核内Abl主要涉及细胞周期、凋亡等过程，而胞浆Abl则参与细胞黏附、细胞骨架重构调控。细胞功能状态影响Abl定位及生物学活性。例如，成纤维细胞和FN黏附结合后，Abl激酶活性可上升1.9-6.8倍［5，6］，并能快速从核内到胞浆，结合到纤维状肌动蛋白（filament actin，F-actin），促使F-actin聚合及粘着斑(focal adhesion)形成［7，8］。这表明Abl激酶在细胞黏附过程中发挥着重要作用。
鉴于不同类型细胞的黏附过程可能具有某些共同的生物学特征，我们推测Abl激酶也可能参与MM细胞的黏附调控过程。2002年De-Vos等［9］采用寡核苷酸阵列分析技术证实，Abl基因在恶性浆细胞中的表达高于正常浆细胞2.9倍。这一事实为研究Abl与MM细胞黏附间的关系提供了生化基础。那么能否用Abl酪氨酸激酶抑制剂STI571来抑制骨髓瘤细胞的黏附，从而逆转其CAM-DR？我们用FN黏附RPMI8226细胞1、6、12小时，黏附率依次递增，分别为(43.71±2.18)%、(55.63±1.56)%、(63.42±2.46)%；而对应的STI571处理组黏附率分别为(15.12±1.04)%、(17.58±1.32)%、(17.24±1.59)%；组间差异显著，说明STI571能明显抑制MM细胞的黏附，与此同时，靶细胞对阿霉素的IC50下降。这一结果表明，STI571能够部分逆转MM细胞的耐药性，也为进一步研究Abl调控F-actin聚合以及CAM-DR形成提供了初步依据。
本研究还发现，20 μmol/L STI571可显著下调骨髓瘤细胞Rac1 mRNA水平。Rac1属于小G 蛋白Rho家族成员，参与actin细胞骨架调控，对细胞黏附过程有重要影响［10，11］，活化的Rac1可促进细胞粘着斑形成，这种作用可以被Rac的负显性突变体阻断。那么在细胞黏附调节中Abl与Rac1关系如何呢？研究表明：Abl激酶可通过某些中间环节活化Rac1进而促使actin聚合，参与细胞黏附［12，13］。这一结果提示Rac1可能作为Abl下游分子参与细胞黏附的调控。本研究证实，STI571可下调Rac1表达，抑制骨髓瘤细胞黏附。这一结果既提示Abl激酶抑制剂 STI571对骨髓瘤细胞黏附功能的干扰可能与Rac1表达受抑密切相关，同时也为Abl激酶通过Rac1间接调控MM细胞黏附这一新观点提供了又一实验佐证。
【】
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