流式微珠阵列法检测IFN-γ诱导的Jurkat细胞Th1/Th2细胞因子表达
【摘要】 本研究旨在探讨流式微珠阵列法检测Th1/Th2细胞因子表达及IFN-γ应用于T淋巴细胞白血病的临床价值。以不同浓度IFN-γ诱导培养Jurkat细胞48小时，用流式微珠阵列法检测培养上清液中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ表达，并采用流式细胞术检测膜上IL-2受体（CD25）的表达。结果表明： IFN-γ诱导Jurkat细胞IL-2和TNF-α的表达呈浓度依赖性升高，未检测到IL-6表达，CD25表达明显升高。结论： Jurkat细胞能被IFN-γ诱导高表达Th1细胞因子和CD25，流式微珠阵列法能准确客观地反映Th1/Th2细胞因子表达的动态变化。
【关键词】 T淋巴细胞白血病
Detection of Expression of Th1/Th2 Cytokines in Jurkat cell Treated with γ-Interferon by Cytometric Bead Array
Abstract In order to explore the value of γ-interferon (IFN-γ) in therapy of T lymphoid leukemia and role of cytometric bead array (CBA) method in detection of Th1/Th2 cytokines expression，the Jurkat cells were cultured for 48 hours in different concentration of IFN-γ，the expressions of IL-2，IL-6，INF-γ and TNF-α in culture supernatants were assayed by CBA method; CD25 expression was assayed by flow cytometry.The results showed that the expressions of IL-2，TNF-α were enhanced in INF-γ dose-dependent way，and the expression of CD25 was also enhanced，but there was no expression of IL-6. It is concluded that Jurkat cells induced by IFN-γ were able to express high-level of Th1 cytokine and IL-2 membrane receptor (CD25)，and the CBA method can be used to exactly evaluate the dynamic change of Th1/Th2 cytokines.
Key words cytometric bead array; Th1/Th2 cytokine; IFN－γ; T lymphoid leukemia
流式微珠阵列（cytometric bead array，CBA）是近年来起来的新技术，可在一份标本中同时检测多达10种细胞因子（IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10），具有快速、简便、准确的特点，而且灵敏度高（可达0.3 pg/ml），可以准确反映Th1/Th2平衡状态［1-4］。有学者认为，IFN-γ可应用于T淋巴细胞白血病治疗，但目前为止并无确凿的实验证据。Jurkat细胞株为T淋巴瘤研究常用模型，因此本研究组以流式微珠阵列法检测IFN-γ诱导的Jurkat细胞Th1/Th2细胞因子表达，同时检测mIL-2R（IL-2膜上受体，CD25）表达，探讨IFN-γ的抗肿瘤效应及作用机制。
材料和方法
材料
RPMI 1640液体培养基（杭州科达生物公司产品），临用前加入15%小牛血清（杭州四季青生物工程公司产品）； Jurkat 细胞株（院上海细胞生物学研究所提供）； IFN-γ（上海克隆生物高技术有限公司生产）； 流式微珠阵列细胞因子检测试剂盒（Bender Medsystems产品，Austria）；CD25 FITC单克隆抗体（美国Becton Dickinson公司产品）。
细胞培养
以含15%灭活小牛血清的完全RPMI 1640培养液，于37℃、5% CO2、饱和湿度下培养Jurkat细胞，每2-3天换液，取对数生长期的细胞进行实验。
给药处理
IFN-γ以完全RPMI 1640培养液配成1×106 U/ml
贮存液，4℃避光保存。以1×106/ml浓度接种对数生长期细胞于6孔板中，培养6小时后给药。各孔药物终浓度分别为0(对照组)、1 000、2 000、4 000、6 000、10 000 U/ml，继续培养48小时，收集细胞用于CD25检测，细胞培养上清液用于细胞因子检测。
IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-2的流式微珠阵列检测
按试剂盒操作说明准备好检测缓冲液、微珠、生物素偶联剂和亲和素标记藻红蛋白（phycoerythrin，PE)，以检测缓冲液预湿微孔板，加入不同浓度细胞因子标准品或25 μl待测细胞培养上清液，同时每孔加入25 μl微珠和50 μl生物素偶联剂，室温振摇（500 rpm）孵育2小时，真空吸干液体，充分洗涤2次，每孔加入100 μl检测缓冲液和50 μl亲和素标记PE，继续孵育1小时，真空吸干液体后洗涤2次，加入200 μl检测缓冲液并转移到试管中，FACScan (Becton Dickinson，USA) 流式细胞仪测定荧光强度，荧光通道为FL-2，采用Flowcytomix Pro分析软件（联科公司附赠）进行分析。
药物处理48小时后Jurkat细胞CD25表达的流式细胞术检测
收集1×106细胞，用PBS洗涤1次后，加入CD25 FITC单克隆抗体，孵育15分钟，充分洗涤后，FACScan流式细胞仪测定荧光强度，激发波长为408 nm，采用Cellquest分析软件进行分析。
统计学处理
每次实验均独立重复3次，以Excell软件和Flowcytomix Pro分析软件处理实验数据。
结 果
IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-2的流式微珠阵列检测
利用Flowcytomix Pro分析软件建立各细胞因子荧光值与其实际浓度的标准曲线（图1），各待测样本细胞因子浓度根据其荧光值由标准曲线自动读出，未以IFN-γ处理的Jurkat细胞中4种细胞因子均不表达，而加入IFN-γ后随浓度的升高，上清液中IL-2和TNF-α浓度明显升高，未检测到IL-6表达（图2）。
CD25检测
IFN-γ在1 000-10 000 U/ml浓度下有诱导Jurkat细胞表达CD25分子的作用。IFN-γ浓度为6 000 U/ml时诱导作用最强，48小时培养后CD25表达率提高8%。IFN-γ浓度大于6 000 U/ml浓度之后，CD25分子表达率不再升高（图3）。
讨 论
流式微珠阵列法以微珠大小和荧光强度（道数）在同一反应体系中区分和定量检测10种细胞因子：细胞因子抗体包被到两种不同大小的微珠上： 5.5 μm（包被IL-2、IL-6、IL-8、IL-10 和IFN-γ单克隆抗体）和4.4 μm(包被IL-1β、IL-4、IL-5和TNF-α、TNF-β单克隆抗体)，同一微珠上的抗体结合不同强度的荧光染料并被激发得到不同的荧光道数。如图1所示，IL-2、IL-6、IFN-γ处于同一微珠不同的荧光检测道数，TNF-α则处于不同的微珠上，因此CBA方法能最大限度地消除不同反应体系所带来的各种误差和同一反应体系内各细胞因子间的交叉反应。本方法能客观动态的反映Th1/Th2细胞因子变化和平衡状态，从而利于我们探讨细胞因子间的相互影响和效应。因流式微珠阵列法的多种优点，美国食品和药物管理局（FDA）和人类基因组计划均要求使用该方法检测细胞因子［5］。
本研究组以CBA法测定IFN-γ诱导Jurkat细胞表达Th1/Th2细胞因子，研究结果显示，IFN-γ处理过的Jurkat细胞IL-2、TNF-α等 Th1型细胞因子表达量呈IFN-γ浓度依赖性升高，同时，CD25（mIL-2R） 表达也明显升高，Th2型细胞因子IL-6则不表达。浓度优势的Th1型细胞因子预示着活跃的抗肿瘤免疫能力： IL-2刺激NK细胞或CTL细胞的杀瘤活性，TNF-α抑制肿瘤细胞增殖并促使其凋亡；CD25表达升高将提高肿瘤细胞对IL-2的敏感性并增强抗肿瘤效应，一般认为这代表预后良好。本研究结果证实，IFN-γ具有应用于T淋巴细胞白血病的潜在价值，同时，本研究首次揭示了Jurkat细胞能被诱导表达Th1类细胞因子及其受体，后者对T淋巴细胞白血病的治疗有着重要意义，即体内T淋巴瘤细胞可能具有同样的诱导表达和形成局部优势的Th1细胞因子的能力，这一点还有待深入研究，但毫无疑问，对于准确和客观地评价体内Th1/Th2细胞因子动态变化，CBA法应当成为首选方法之一。
【】
1Hodge G，Hodge S，Haslam R，et al.Rapid simultaneous measurement of multiple cytokines using 100 sample volumes-association with neonatal sepsis.Clin Exp Immunol，2004； 137:402-407
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3Aoe K，Hiraki A，Murakami T，et al.Relative abundance and patterns of correlation among six cytokines in pleural fluid measured by cytometric bead array.Int J Mol Med，2003;12:193-198
4Morgan E，Varro R，Sepulveda H，et al.Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.Clin Immunol，2004;110:252-266
5Tarnok A，Hambsch J，Chen R，et al.Cytometric bead array to measure six cytokines in twenty-five microliters of serum.Clin Chem，2003;49(6 pt 1):1000-1002
