人CD14转基因细胞系的建立
作者：宁铂涛，汤永民，徐妍，陈燕飞，曹江
【摘要】 本研究构建人CD14真核表达质粒，建立转基因CD14阳性细胞系，为建立急性单核细胞白血病（M5）导向动物模型提供研究材料。 从正常人外周血单个核细胞抽提总RNA，以无RNA酶的DNA酶处理，RT-PCR扩增CD14基因，T-A克隆测序并与GenBank中人CD14的基因序列比较核实。通过双酶切和体外连接法将目的基因克隆至表达载体pcDNA 3.1 (+ )； 用Superfect transfection reagent 将重组质粒pcDNA 3.1（＋）/CD14 转染到C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16，经G418 筛选，用流式细胞术检测CD14蛋白的表达情况，初步筛选出CD14阳性的细胞系B16/CD14。结果表明：测序及GenBank中序列比较结果显示扩增到的人CD14基因序列是正确的，酶切结果表明表达质粒构建正确。流式细胞术筛选到2个CD14阳性表达的细胞系B16/CD14（标准CD14-PE阳性细胞百分数分别为25.28％、36.59％，2F9-FITC为25.59%、36.32%）。结论： 建立了人CD14抗原阳性表达的鼠细胞系B16/CD14，为人M5动物模型的建立及其导向治疗的研究奠定了坚实的基础。
【关键词】 转基因细胞系
Establishment of Murine Cell Line Transfected with Human CD14 Gene
Abstract This study was aimed to construct the CD14 eukaryotic expression vector，establish the transgeneic CD14 positive cell line in order to facilitate the establishment of a mouse model of antibody targeting therapy for human acute monocytic leukemia (AML-M5). Total RNA extracted from peripheral blood mononuclear cells was treated with RNAase-free DNAase，the human CD14 gene was cloned and sequenced through the RT-PCR and T-A clone techniques.Eukaryotic expressional vector pcDNA3.1(+)/CD14 was constructed by cleaving with double restriction endonuleases and ligating with T4 ligase.A murine melanoma cell line B16 was transfected with the pcDNA3.1(+)/CD14 recombinant with Superfect transfection reagent.Positive clones were selected by G418 and the expression of human CD14 on the transfectant was confirmed by flow cytometry (FCM).The results indicated that the sequence of the human CD14 cDNA cloned was exact to be same as the one from GenBank database.The recombinant pcDNA3.1(+)/CD14 was identified with double-enzyme cleaving.The expression of the human CD14 on the transfectant (B16/CD14) was confirmed by FCM.In conclusion，the murine cell line B16/CD14 fransfected with human CD14 gene has been established which can be used for the study of human AML-M5 antibody targeting therapy with mouse model.
Key words CD14；transgeneic cell line；acute monocytic leukemia; mouse model
急性单核细胞白血病（AML-M5）是难治性白血病之一，CD14是M5细胞膜上的特异性标志，它在其它细胞成分包括T、B、杀伤细胞(NK)、红细胞、血小板、造血干/祖细胞以及非造血系统细胞上不表达［1］，并且单核细胞能通过CD14将与CD14抗原分子结合的分子内吞入细胞内［2］，因此CD14是导向治疗AML-M5的良好靶点。本研究组已经将自制鼠源性抗人CD14单克隆抗体（ZCH-7-2F9）研制成基因工程抗体，拟进一步进行动物试验。为了建立良好的动物模型，一个稳定表达人CD14抗原分子的肿瘤细胞系是重要的环节。然而，除病人新鲜M5细胞外，国际上很少有CD14表达的单核细胞系存在，从而对该研究的深入进行带来困难。目前，大多数研究室仍然通过VitD3诱导单核细胞来源的细胞株U937 来获得CD14阳性表达的细胞系［3］，这不仅不能保证CD14表达的均一性，也不利于人M5白血病动物模型的建立及其体内导向治疗的研究，通过转基因技术建立表达人CD14抗原的鼠肿瘤细胞系是解决这一问题的可行途径。为此，我们利用C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16的高效转染性，初步建立人CD14抗原阳性表达的鼠细胞系B16/CD14，为CD14阳性白血病动物模型的建立奠定了基础。
材料和方法
标本、主要试剂及仪器
单核细胞来自正常人外周血，进口直标单克隆抗体CD14-PE、γ1-FITC、γ1-PE为美国Becton Dickinson公司产品；2F9-FITC为本实验室研制的直标鼠抗人CD14单克隆抗体试剂；TrizoL液、高保真度Taq DNA 聚合酶、Low DNA Molecular Mass Ladder标准分子量购自Invitrogen公司；M-MLV逆转录酶、RNasin○R核糖核苷酸酶抑制剂、RQ1无RNA酶的DNA酶、pGEM○R-T Easy Vector系统、X-gal（5-嗅-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）、IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）购自Promega公司；QIAquick DNA 纯化试剂盒购于Qiagen公司； RPMI 1640培养基、EcoRI、HindⅢ和XbaⅠ内切酶及G418购于Gibco BRL公司；全自动测序仪（ABI PRISM377）为P-E公司仪器；FACSCabliburTM流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司；哺乳动物表达载体pcDNA 3.1 (+ ) 购自Invitrogen 公司。
细胞株及受体菌
C57BL/6黑色素瘤细胞B16冻存于浙江大学附属邵逸夫中心试验室；大肠
杆菌DH5α由曹江博士惠赠。
引物
根据NCBI GenBank检索的人CD14 cDNA序列设计上下游引物，分别含有HindⅢ 和XbaⅠ酶切位点，委托上海生物技术工程有限公司合成： 上游引物为：5′ A↓AGCTTATGGAGCGCGCGTCCTGCTTGTTGCTG 3′ （HindⅢ），下游引物为：5′ T↓CT AGATTAGGCAAAGCCCCGGGCCCCTTGGAGC 3′ （XbaⅠ）。
重组质粒pcDNA3.1（＋）/CD14的构建
取正常人的外周血2 ml，以等体积的磷酸盐缓冲液（phospholate buffer solution，PBS）稀释，加入2 ml的淋巴细胞分离液，3 000×g离心20分钟，分离得到单个核细胞，以1 ml的TrizoL液溶解细胞，抽提总RNA并进行逆转录，以上述引物进行扩增，得到CD14基因片段。PCR反应条件为：94℃ 5分钟，94℃ 30秒，57℃ 30秒，72℃ 50秒，共30个循环，72℃延伸7分钟。0.8％琼脂糖电泳显示扩增出目的基因片段，取PCR产物2 μl克隆到pGEM○R-T Easy Vector中，命名为pGEM○R-T Easy /CD14，EcoRI酶切结果阳性的克隆纯化后委托上海博亚公司采用ABI PRISM377进行测序分析，测序结果与GeneBank中检索的结果对比核实。HindⅢ和XbaⅠ双酶切纯化的pGEM○R-T Easy/CD14和pcDNA3.1(+)，0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIA quick Gel，切胶回收目的片段和空载体，按摩尔比3∶1进行连接，连接产物转化DH5α感受态，挑取单菌落扩大培养后抽提质粒，HindⅢ和XbaⅠ双酶切鉴定，将重组质粒pcDNA3.1（＋）/CD14纯化后转染B16细胞。所涉及的酶切、连接、重组子的筛选及大量制备等实验方法均《分子克隆实验指南》［4］ 进行。
细胞培养
小鼠黑色素瘤细胞B16用含10％小牛血清、100 μg/m l 链霉素、100 U/m l 青霉素的RPMI 1640培养液，在5％ CO 2 浓度、饱和湿度及37℃培养条件下培养。
重组质粒转染B16细胞及G418抗性克隆的筛选
用RPMI 1640培养液 (含小牛血清与双抗) 将细胞悬液配成1×105/ml浓度，以2 ml/well于6孔板，24 小时后，将纯化的质粒pcDNA 3.1 (+ ) 和pcDNA 3.1(+ )/CD14，用Superfect tran sfection reagent并按其操作说明转染B16细胞。24小时后换液，加G418进行筛选，每孔浓度为800 μg/ml。转染第12天，对6孔板上存活的细胞继续培养，G418浓度为800 μg/ml，待明显的克隆长出来后，将单个克隆挑到24孔板扩大培养，G418浓度为800 μg/ml。
CD14强阳性细胞系B16/CD14的初步筛选
用消化液将24孔板的细胞消化后，PBS洗涤2次，按照1×105细胞/管加入流式细胞仪专用管，并加入2.5 μl标准CD14-PE和2F9-FITC，阴性对照及未转染的B16细胞组分别加入γ1-PE 、CD14-PE、γ1-FITC和2F9FITC，4℃反应30分钟，PBS充分洗涤，用FACSCabliburTM流式细胞仪和CellQuest软件获取并分析10 000个细胞。
结 果
CD14 cDNA的扩增
RT-PCR产物琼脂糖电泳结果显示扩增到1128 bp大小的目的基因片段（图1），EcoRI酶切白色菌落抽提的质粒，10个克隆有9个克隆中有约1 200 bp的目的片段（图2）。将其中1个EcoRI酶切阳性的质粒pGEM○R-T Easy /CD14纯化测序。结果表明，扩增到的CD14基因与GenBank中的人CD14 cDNA序列完全一致。
重组质粒pcDNA3.1（＋）/CD14的鉴定
pcDNA3.1（＋）/CD14经HindⅢ和XbaⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳可见1 128 bp的CD14基因片段（图3）。Figure 3.Restriction analysis of pcDNA3.1(+)/CD14 with Hind Ⅲ and XbaⅠ.
转染后B16细胞的G418筛选
B16细胞转染pcDNA3.1（＋）/CD14和pcDNA3.1（＋）后，经G418加压筛选，未转染的B16细胞在含G418的RPMI 1640培养液中，第10天全部离壁死亡，第12天转染组细胞绝大部分死亡，但可见散在生长的G418抗性细胞克隆。
CD14阳性B16/CD14细胞的筛选
应用标准的鼠抗人CD14直标单克隆抗体CD14-PE和自行研制的鼠抗人CD14直标单克隆抗体2F9-FITC，通过流式细胞术检测到2株CD14部分阳性表达的B16/CD14细胞系，CD14阳性细胞百分数和平均荧光强度（MFI）分别见图4。
讨 论
M5是急性髓系白血病（AML）中的常见类型，可分为未分化型(M5a)和部分化型(M5b)两种类型，它们恶性程度高，对化疗反应较差，长期预后不良。大量研究表明，M5细胞表面具有大量内毒素脂多糖(LPS)受体CD14分子表达，且该分子特异性好、敏感性高，用抗人CD14单克隆抗体能识别结合该抗原分子，它是诊断M5的重要标志［5，6］。CD14不仅是LPS和LPS/LBP复合物的受体，更是髓系单核/巨噬细胞分化的特异性表面标志抗原，主要在正常单核细胞和巨噬细胞上表达以及在单核细胞相关性白血病细胞上大量表达，在其它细胞系统上不表达，在正常粒细胞上仅微弱表达或不表达［1］，且单核细胞能通过CD14将与CD14抗原分子结合的分子内吞入细胞内［2］，这为CD14作为靶向M5等单核细胞相关性疾病提供了有利条件。为了建立人M5白血病的动物模型以便能更好地进行M5白血病的体外及体内导向治疗研究，我们通过脂质体转染法，利用B16细胞的高效转染性，建立了两株人CD14抗原阳性表达的鼠细胞系B16/CD14。
人类编码CD14的基因已经被克隆和测序。该基因位于5q31.1，其基因组DNA约含1 338个核苷酸残基。从第76位核苷酸到第1 200位，编码一段375个氨基酸残基的多肽链［7］，它由2个外显子编码，其中第1个外显子只含1个起始密码子ATG，紧接着是1个含88个核苷酸残基的内含子［8］。为了避免基因组DNA的污染，我们对单核细胞抽提的总RNA采用无RNA酶的DNA酶进行消化，保证了PCR模板是来自CD14的cDNA，而不是其基因组DNA。此外，由于CD14基因的编码区超过1 kb，为了确保PCR过程中Taq酶的忠实性，我们采用高保真Taq酶。测序结果和互联网数据核实情况表明，我们所扩增的1 128 bp的人CD14基因序列是完全正确的。
B16细胞是来源于小鼠黑色素瘤的细胞株，本身不表达CD14分子，且其对pcDNA3.1等多种质粒具有高效转染性［9］。G418对哺乳动物细胞具有高度的毒性，在400 μg/ml的浓度下大部分的真核细胞即不能存活。只有转染了含G418抗性基因的重组质粒并表达的B16细胞才可以存活生长。我们对有G418抗性的24个克隆进行扩大培养，每个克隆收集1×105细胞，采用国际标准直标单克隆抗体CD14-PE和自行研制的鼠抗人CD14直标单克隆抗体2F9-FITC［10］，通过流式细胞术检测发现2个克隆的部分转染细胞表达CD14，CD14-PE检测的阳性细胞百分数分别为25.28％和36.59％，2F9-FITC检测结果分别为 25.59%和36.32%％，而未转染和转染pcDNA3.1（＋）的B16细胞两种单克隆抗体检测结果均为阴性。这些结果说明人CD14抗原在B16细胞膜上成功地得到表达，但是由于挑选贴壁细胞集落时不能做到1个集落来自于1个细胞，或者集落培养的过程中部分G418抗性的细胞发生目的基因的丢失，使这两个集落有些G418抗性细胞不表达或低表达CD14分子。
本研究中，我们建立了2株人CD14阳性表达的细胞系B16/CD14，并拟用G418选择培养基亚克隆后获得均一的、高纯度的、人CD14强阳性的细胞株。人CD14抗原阳性表达的鼠细胞株B16/CD14的建立必将为人M5白血病动物模型的建立及其导向治疗研究奠定坚实的基础。
【】
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