人骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖和化疗敏感性的影响
作者：林玉梅，卜丽梅，杨少娟，高申，张桂珍
【摘要】 本研究比较K562细胞与正常人骨髓间充质干细胞（MSC）黏附培养前后细胞增殖、化疗敏感性及MDR1变化，以寻找白血病耐药与造血微环境的关系。对悬浮培养和与MSC黏附培养的K562细胞绘制细胞生长曲线；用流式细胞术测定细胞周期并观察化学药物对细胞存活率和凋亡的影响；用RT-PCR技术检测MDR1基因表达。结果表明：与悬浮培养比较，黏附培养K562细胞增殖受抑，G0/G1期细胞比例增加 (P<0.05)，S期细胞比例下降 (P<0.05)，G2/M期细胞比例增加(P<0.01)。在柔红霉素（DNR）诱导的凋亡中，黏附培养组K562细胞凋亡受阻 (P<0.05)。黏附培养未诱导K562细胞MDR1基因表达，也未使K562/ADM细胞的MDR1基因表达发生改变。结论： K562细胞与MSC黏附接触共培养，可导致K562细胞生长抑制，并产生化疗耐药，其机制可能与MDR1无关。
【关键词】 骨髓间充质干细胞
Influence of Human Mesenchymal Stem Cells on Cell Proliferation and Chemo-sensitivity of K562 Cells
Abstract This study was aimed to compare K562 cell proliferation，chemo-sensitivity and alteration of MDR1 before and after adhesive culture with MSC，so as to evaluate the relationship between chemodrug-resistance of leukemia cells and hemopoietic microenvironment. K562 cell cultivated in suspension and adhesively cultivated with MSC were collected respectively and cell proliferation curves were drawn; the cell cycle was determined by flow cytometry; the effect of chemotherapy on cellular viability and apoptosis of K562 cell was investigated，the MDR1 gene expression was determined by RT-PCR. The results showed that K562 cells adhesively cultivated with MSC were inhibited and cells in G0/G1 increased (P<0.05)，cells in S phase decreased (P<0.05) and those in G0/G1 increased (P<0.01)，compared with that cultivated in suspension.In process of daunomycin-inducing apoptosis，K562 cell apoptosis in the adhesive culture with MSC was inhibited (P<0.05).MDR1 gene expression in K562 cells was not induced or altered by adhesive co-cultivation.It is concluded that by co-culture of cell-cell contact with MSC，growth suppression and induction of chemo-resistance of K562 cells take place.The mechanism，however，seems not relevant with MDR1.
Key words mesenchymal stem cell; K562; drug resistance; apoptosis; MDR1
耐药是根治白血病的最主要障碍，其发生机制及逆转的研究一直是白血病的研究热点，以往人们主要集中在对单个白血病细胞本身的分子生物学改变的研究，并取得了显著成果，但在体内仍难克服耐药的发生。近年来，随着对骨髓造血微环境（hematopoietic microenviroment，HM）的认识不断加深，发现骨髓基质细胞在白血病细胞恶性克隆的增殖、分化和凋亡中起重要作用［1］。而骨髓基质细胞的前体细胞骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是骨髓造血微环境中基质细胞的主要来源，对正常造血也具有调控作用，但对白血病细胞的调节作用尚不清楚。本研究以人慢性髓细胞白血病K562细胞株为靶细胞，与正常人MSC共培养，观察其对K562细胞增殖和化疗敏感性的影响，以探讨MSC与白血病耐药的关系。
材料和方法
试剂
柔红霉素、阿霉素（DNR、ADM)，均购自Pharmacia公司；DMEM-LG、RPMI 1640培养液购自Gibco公司；FBS 购自Hyclone公司； RT-PCR试剂盒、蛋白酶K、RNA酶及琼脂糖均购自Promega公司； PCR引物由上海生物工程公司合成。TRIZOL购自Invitrogen公司；Percoll(密度1.073 g/ml)，购自Amersham Biosciences公司。碘化丙锭（PI）购自美国Coulter-Immunotech公司。
人骨髓MSC的分离和培养
骨髓MSC的分离、纯化和扩增按Pittenger等［2］报道的方法进行。取肝素抗凝健康自愿者骨髓液5 ml，用Percoll分离液分离单个核细胞（MNC），以2.0×105/cm2细胞接种于75 cm2的Nunc培养瓶内，培养体系为含10% FBS的DMEM-LG，置于37℃、5% CO2饱和湿度的孵箱中进行原代培养。培养48小时后换液，除去非贴壁细胞，以后每3天换液1次。待覆盖培养瓶底面积的80%以上时加入0.25%胰蛋白酶消化传代，按5×103/cm2传代培养，每3天换液1次。2-4代细胞用于实验。
人骨髓MSC表面标志的鉴定
将胰蛋白酶消化收获的MSC以2×105个细胞分别与抗CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD105、CD166、HLA-A/B/C和HLA-DR（PharMingen公司）室温反应30分钟，经PBS洗涤2次后与标记FITC的二抗避光反应15分钟，细胞洗涤后悬浮于PBS中以备流式细胞仪分析。
K562细胞与MSC黏附培养
K562/ADM细胞株，购于医学院血液学研究所，在ADM 1.0 μg/ml的含10% FCS的RPMI 1640培养液中稳定生长。试验前2周换用无ADM的培养液培养。K562细胞株由本中心研究室提供，培养体系同上。已传代的MSC以1×104 /cm2接种于75 cm2的培养瓶中，待细胞贴壁呈融合状态时在其上分别直接加入对数生长期的K562和K562/ADM细胞（1×105/ml）。48小时后先去除未黏附的白血病细胞，根据报道方法［3］吹打收集黏附生长的白血病细胞。
细胞生长曲线测定
悬浮培养组
取生长状态良好的K562细胞接种于24孔培养板，每孔1 ml，含1×104细胞，每3天换液1次。
黏附培养组
已传代的MSC接种于24孔培养板，每孔1 ml，含1×104细胞，待MSC完全贴壁融合后，在其上直接加入悬浮生长的K562细胞1×104，体积同上。
每组均3天换液1次。在第1至8天分别收集各组K562细胞，台盼蓝染色记数活细胞数，每组有3个平行孔，取均值。最后以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制生长曲线。
细胞周期的流式细胞术（FCM）测定
分别取悬浮培养和黏附培养48小时的K562细胞2×106，用冷PBS洗2次，加入预冷70%乙醇固定，4℃过夜，RNase处理30分钟后离心，PI染色30分钟，用流式细胞仪检测。每组实验重复3次，取均数。
黏附培养对K562细胞药物敏感性的影响
MSC接种于24孔培养板，分2组。待细胞贴壁呈融合生长状态时，在其上直接加入悬浮生长的U937细胞，48小时后计数1组K562细胞数。另1组与相同细胞数的悬浮培养组平行加入含不同浓度DNR（0.1-3.2 μg/ml）的培养液，于24小时收集白血病细胞，通过台盼蓝排斥实验检测细胞活率。每组3个平行孔，取均数。
细胞凋亡的FCM检测
不同浓度的DNR作用24小时后，分别收集悬浮和黏附培养组K562细胞 2×106，方法同细胞周期检测，出现亚G1峰的细胞为凋亡细胞，获得凋亡率。每组实验重复3次，取均数。
DNA片段的琼脂糖凝胶电泳检测
不同浓度的DNR作用24小时后，分别收集悬浮和黏附培养组K562细胞 2×106，加细胞裂解缓冲液（1 mmol/L tris-HCl，pH 8.0，10 mmol/L EDTA，pH 8.0，200 mg/L蛋白酶K，0.5% SDS），在50℃保温3小时，使细胞充分裂解，酚氯仿抽提DNA，在抽提液中加1/10体积的2 mol/L naAc和2倍体积的乙醇，使DNA沉淀，-20℃过夜。4℃、1 000×g离心，DNA沉淀用TE缓冲液溶解，加入RNA酶200 mg/L，37℃保温1小时，2%琼脂糖凝胶电泳2小时，观察DNA ladder形成。
MDR1基因表达的RT-PCR测定
MDR1上游引物：5′-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3′；下游引物：5′-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3′，扩增片段157 bp。以β-actin作为内参照（扩增片段418 bp）。用TRIZOL抽提总RNA，RT-PCR参照试剂盒说明书操作，反应条件：45℃逆转录45分钟，94℃ AMV RT灭活和RNA/cDNA引物变性2分钟。循环参数：94℃ 30秒，60℃ 1分钟，68℃ 2分钟，40个循环后68℃再延伸7分钟。取扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。
统计学处理
应用SPSS 10.0软件分析结果，率的比较用χ2检验，两样本间均数比较用t检验。
结 果
MSC的生长特点及免疫表型特征
分离的骨髓单个核细胞于接种24小时时即可见大量贴壁略伸展的细胞，72小时后出现典型的纺锤细胞，4天左右形成克隆。MSC贴壁稀疏时，长梭形细胞的两极朝向不，细胞排列混乱，细胞之间往往通过突起相连接。近3周时出现致密的细胞层，细胞两极有规律的排列成束状或旋涡状。传代后MSC生长迅速，近10天时细胞即可融合。用流式细胞仪分析了MSC的表面抗原标记。结果显示，MSC表达CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、HLA-A/B/C，而CD34、CD45、HLA-DR则呈阴性。
MSC对K562细胞增殖动力学的影响
K562细胞与MSC黏附培养8天后，从细胞生长曲线可以看出，K562黏附培养4天时起细胞增殖与悬浮组比较受到明显抑制 (P<0.05)（图1）。FCM检测悬浮与黏附培养后K562细胞各时相细胞的百分率如附表所示。与悬浮培养相比较，黏附培养后K562细胞G0/G1期细胞增加 (P<0.05)、G2/M期细胞增加 (P<0.01)，S期细胞减少 (P<0.05)。这说明K562细胞与MSC接触培养后使细胞周期各时相细胞量发生改变，增殖率下降，主要阻滞在G0/ G1期。Table.Cell cycle distribution of K562 cells cultivated in suspension and adhesively cultivated in contact with MSCs（略）
化学药物对K562细胞存活的影响
不同浓度DNR作用于悬浮培养组和黏附培养组K562细胞，在24小时时细胞的存活情况如图2。与MSC黏附培养后，细胞存活率提高，在DNR浓度为0.8、1.6 μg/ml时明显降低了K562对DNR的敏感性 (P<0.05)，说明MSC诱导了K562细胞对DNR耐药的发生。
细胞凋亡的变化
DNR与K562细胞共培养24小时之后，用FCM检测K562细胞凋亡率，当DNR浓度分别为0.1、0.4、0.8 μg/ml时，黏附组的平均凋亡率分别为4.0%、7.8%和14.5%，而悬浮组的凋亡率分别为5.3%、11.7%和23.8%，在0.8 μg/ml时凋亡率有显著差异 (P<0.05)。分别用0.8 μg/ml和1.6 μg/ml DNR作用于K562细胞24小时时，DNA凝胶梯度电泳结果见图4。悬浮培养组在1.6 μg/ml时有DNA片段形成，并呈较明显的凋亡DNA梯形带。而在同等DNR浓度下，黏附组则未见DNA片段梯形带形成。这证明与MSC黏附培养能抑制DNR诱导白血病细胞凋亡。
MDR1表达的影响
K562和K562/ADM分别与MSC黏附培养对MDR1基因表达的影响见图5。由图5可见黏附培养后未诱导K562细胞表达MDR1，同时也未使MDR1阳性的K562/ADM表达发生改变，说明与MSC黏附培养对K562细胞MDR1基因表达未产生影响。
讨 论
骨髓MSC可分化为成纤维细胞、脂肪细胞等一组不均质细胞组成的基质细胞。研究证实，骨髓基质细胞可通过黏附反应来直接调控造血细胞的功能，并对造血系统恶性肿瘤细胞的增殖、分化也起重要作用。HL-60及U937细胞株与正常成人骨髓成纤维样基质细胞黏附培养后均可导致G1期细胞增多，S期细胞减少，直接抑制白血病细胞增殖，阻断细胞周期运行［4，5］。本研究把K562细胞与正常成人骨髓MSC进行黏附培养，细胞增殖受抑，K562细胞除表现处于G0/G1期细胞增多外，还发现S期细胞明显减少，G2/M期细胞明显增多，这证明MSC可阻滞细胞周期进程，提示MSC与白血病细胞黏附在白血病耐药的产生中可能起重要作用。Konlpleva等［6］报道，当HL-60和NB-4细胞系与鼠MS-5基质细胞共培养时，Ara-C诱导的凋亡减弱，有人把急性淋巴细胞白血病细胞与骨髓基质细胞共培养，发现由Ara-C和Vp16诱导的调亡降低［3］。除了白血病，Nefedova等［7］发现当骨髓瘤细胞系黏附于骨髓基质细胞时，骨髓瘤细胞凋亡抑制率超过50%以上。新近Tabe等［8］报道，骨髓MSC起源的脂肪细胞与早幼粒白血病细胞直接接触，可降低全反式维甲酸和阿霉素诱导凋亡的作用。本研究结果发现，当K562细胞与MSC黏附培养时，对DNR的敏感性下降，在相同浓度DNR作用下凋亡率下降，这证明了与MSC黏附培养可诱导K562细胞对DNR耐药的形成。抑制细胞增殖是白血病的有效方法，但也是根治该病的重要障碍，因为它使细胞对药物不敏感，进而促进骨髓微小残留病（ minimal residual disease，MRD）的产生。骨髓MSC和其分化的基质细胞对白血病细胞周期的调控作用在白血病耐药的形成中可能起重要作用。
研究发现，与基质细胞黏附共培养诱导白血病细胞增殖受抑、凋亡受阻的机制在不同的细胞系有所不同。 HL-60和NB-4细胞系与鼠MS-5基质细胞共培养时，白血病细胞Bcl-2表达水平升高［5］，而α4β1整合蛋白阳性的急性髓系白血病细胞与骨髓基质细胞黏附培养后是通过PI-3k/AKT/Bcl-2信号途径产生耐药［9］。这些结果说明，这种细胞间的直接黏附作用对白血病细胞增殖、凋亡的调节机制是复杂的，是由细胞周期和凋亡的多重调控机制和通路完成的。同时，MSC由于能产生多种细胞因子，故还可能通过细胞因子的旁分泌作用或MSC-白血病细胞间反应所诱导产生的细胞因子共同参与作用。另外，为了明确MSC与白血病细胞多药耐药的关系，本研究对黏附培养后K562和K562/ADM细胞的MDR1基因表达进行了测定，结果表明黏附培养并未诱导K562细胞表达MDR1，也未使K562/ADM细胞MDR1表达发生改变。
总之，白血病细胞与骨髓MSC直接接触对AML化疗敏感性、骨髓MRD的和预后可能起重要影响。
【】
1Gibson LF.Survival of B lineage leukemic cells ： signals from the bone marrow microenvironment. Leuk Lumphoma，2002；43：19-27
2Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cell. Science，1999；284（5411）:143-147
3Mudry RE，Forthey JE，York T，et al. Stromal cells regulate survi-val of B-lineage leukemic cells during chemotherapy. Blood，2000；96：1926-1932
4梁蓉，黄高升，陈协群等.人成纤维样基质细胞系对HL-60细胞增殖和VEGF表达的影响. 实验血液学杂志，2003；11：476-479
5梁蓉，黄高升，王哲等. 正常人骨髓成纤维样基质细胞系对白血病细胞U937增殖的影响. 第四军医大学学报，2003；24：1560-1562
6Konlpleva M，Konoplev S，Hu W，et al. Stomal cells prevent apoptosis of AML cells by up-regulation of anti-apoptotic proteins. Leukemia，2002；16:1713-1724
7Nefedova Y，Landowske TH，Dalton WS. Bone marrow stromal-derived soluble factors and direct cell contact contribute to de novo drug resistance of myeloma cells by distinct mechanisms. Leukemia，2003；17：1175-1182
8Tabe Y，Konopleva M，Munsell MF，et al. PML-RAR alpha is associated with leptin-receptor induction: the role of mesenchymal stem cell-derived adipocytes in APL cell survival.Blood，2004 ；103:1815-1822
9Matsunaga T，Takemoto N，Sato T，et al. Interavtion between leukemic-cell VLA-4 and stromal fibronectin is a decisive factor for minimal residual diseade of acut myelognous leukemia.Nat Med，2003；9：1158-1165
