大黄素增强结肠近端平滑肌细胞钙离子依赖氯离子通道的表达
作者：娄婷 杨静 徐龙 余保
【摘要】 目的： 研究大黄素对结肠近端平滑肌细胞钙离子依赖氯离子通道（ClCa channel）的作用。 方法： 采用RM6200四道仪记录黄体酮对平滑肌的等长收缩活动作用，相对定量的单细胞RT?PCR法检测平滑肌细胞ClCa通道mRNA的表达。 结果： 大黄素显著增强离体结肠平滑肌肌条和单个平滑肌细胞的收缩，并可使ClCa电流显著增强，作用与剂量呈正相关。DIDS和NFA可阻滞大黄素的作用。豚鼠近端结肠平滑肌细胞有ClCa1和ClCa2基因的mRNA表达， ClCa1基因的mRNA表达强度是ClCa2基因的mRNA的5.3±0.71（n=5, P<0.01）倍。50μM大黄素孵育可以使ClCa1基因的mRNA表达增强（n=5, P<0.01）。结论： 大黄素可通过兴奋氯离子通道电流引起结肠平滑肌收缩，大黄素对氯离子通道兴奋作用可能与增强结肠平滑肌细胞ClCa1基因表达有关。
【关键词】 结肠； 平滑肌细胞； ClCa通道； 膜片钳； 豚鼠
大黄素(emodin) 是大黄(Rhubarb)有效成分蒽醌类衍生物之一，已被证实可增强肠道蠕动，促进平滑肌细胞的收缩活动［1,2］。钙离子依赖氯离子通道(Ca2+activated Cl- channels, ClCa Channel)是平滑肌组织中非常重要的，与收缩密切相关的离子通道。而大黄素对ClCa通道的作用，国内外未见相关报道。本研究利用全细胞膜片钳和相对定量的单细胞RT?PCR等技术研究大黄素对大鼠近端结肠ClCa通道以及基因表达的影响，进一步探讨大黄素促结肠动力作用机制。
1 材料与方法
1?1 标本制备健康成年清洁级豚鼠，250～300g，雌雄不拘，卒击枕部至昏，断颈放干血液，剖腹取6cm 左右长的近端结肠，迅速放入充以95 % O2 和5 % CO2的混合气的Tyrode 液中，沿肠系膜纵行剪开，将去黏膜的组织剪成宽3 mm、长15 mm 的结肠带肌条和环行平滑肌肌条。制备单个平滑肌细胞［2］时，将肌条剪松置于消化液中，37 ℃下轻微振荡孵育20～30 min，用Ca2+?free PSS液洗5次，然后组织块用广口火抛光的吸管吹打，产生细胞悬液。所有肌条（包括酶消化的肌条）备用时均保存于2～8℃的K?B液中。
1?2 肌条实验取一肌条固定于浴槽中，可自由收缩的一端用丝线与等长传感器相连。用含钙Tyrode液灌流标本，充以95 % O2 和5 % CO2 的混合气，pH为7.4 ，灌流速度3 ml·min-1，温度37℃±0.5℃。待标本出现的自发节律性收缩并稳定30min后，记录正常状态下电和收缩活动的指标，然后分别以含有5μM、10 μM、20 μM、40 μM和80 μM等不同浓度大黄素（或添加氯离子通道拮抗剂）的含钙Tyrode 液灌流，记录药物对收缩活动的影响。肌条收缩活动的测量采用等长传感器将机械收缩转换为电信号，输出的信号在RM?6200 型四导生理记录仪上绘出。肌张力表示为曲线下至绝对基线之间的平均面积（g/s）。位相性收缩基线规定为所检测的位相性收缩之前10s内的水平线，位相性收缩的幅度为收缩曲线与位相性收缩基线之间的平均面积（g/s）。
1?3 单个平滑肌细胞收缩的测量［3］酶消化的肌条使用前用广口火抛光的吸管吹打成细胞悬液，取约1~2ml细胞悬液置于倒置显微镜的灌流槽底部的盖玻片上。将细胞外液换为Ca2+?PSS，应用显微影像输出系统将图像输出到机中，用图像分析系统软件分析30个平滑肌细胞的收缩活动。观察不同浓度大黄素对平滑肌细胞收缩的作用，收缩活性表示为细胞长度缩短的百分数。
1?4 平滑肌细胞的RT?PCR用酶分离方法［4］分离单个细胞检测结肠平滑肌细胞ClCa 家族基因（ClCa1, 2, 3 and 4）mRNA的表达。.在细胞贴附倒盖玻片上后，在相差显微镜下，通过广口火抛光的硅玻璃电极负压吸引将平滑肌细胞吸入电极内，然后将电极内容物注入0.5 ml EP管，收集60个平滑肌细胞。所有的细胞在液氮中速冻，-80℃冰箱中保存。将去粘膜平滑肌条在含5% BSA 的37℃大黄素或Tyrode液中孵育20min，观察大黄素对ClCa通道基因mRNA表达的影响。孵育后的肌条用以上的方法分离、收集并保存40个平滑肌细胞。TRIzol(Gibco)提取总RNA，Revert Aid TM First Strand cDNA合成试剂盒（K1621 Fermentask, life sciences）合成cDNA，并进行PCR扩增。取2μg RNAs 进行两次PCR扩增，每次35个循环。ClCa1, 2, 3 and 4和β?actin的引物用primer5.0设计，在上海生工合成。引物的基因名称、氨基酸序列、产物长度和基因号见表1。
表1 所检测ClCa基因名称及其引物和产物列表（略）
然后10 μl的PCR产物在1.5% agarose gel上进行变性电泳，用ethidium bromide标记。Gel Doc XR 系统(Bio?Rad, Hercules, )分析和定量产物的荧光强度。目的基因的相对荧光强度用同一标本β?actin的荧光强度作标准化处理，用率的百分数表示(ClCa mRNA / beta?actin，%)。
1?5 溶液( mM) 与试剂所有试剂均购自Sigma公司。改良tyrode液: 126 NaCl, 5.4 KCl, 2.0 CaCl-, 1.0 MgCl-, 0.33 NaH2PO4, 10 glucose and 10 Hepes; pH用NaOH调节至7.4。生理盐水(CaPSS) : 135 NaCl, 5.0 KCl, 2.0 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10.0 Glucose 和10 HEPES，pH用Tris调节至7.4。Ca2+?free PSS除了不含CaCl2其余成分与CaPSS相同。消化液为含如下试剂的Ca2+?free PSS液: 0.12%(wt/vol)胶原酶(Collagenase), 0.12% (wt/vol)胰蛋白酶抑制剂(Bitorsoybean Trypsin Inhibitor)和0.2%小牛血清(BSA)。
1?6 统计学处理数据用±s表示。在剂量依赖试验中，5种浓度梯度的大黄素用算术大小排列，并使用origin5.0进行统计处理和计算半数有效量（EC50）。所有的统计分析均采用配对t 检验，P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2?1 大黄素促进离体结肠平滑自发性位相性收缩大黄素可以增强离体结肠平滑肌的自发性位相性收缩，收缩的频率为20.35±0.52bpm （n=27），大黄素（50μM）不能改变位相性收缩的频率(19.74±0.42bpm, n=7)。位相性收缩的幅度平均值为1.2±0.2 g/s，大黄素可以增加位相性收缩的幅度，但无明显的剂量效应关系，50 mM时可使位相性收缩的幅度增高至2.0±0.4g/s（n=8, P< 0.01）。5 mM DIDS (1.1±0.14g/s，n=6，P>0.05) 和100μM NFA (1.2±0.12 g/s，n=7，P>0.05) 可以阻滞大黄素的这种作用。见图1。
2?2 大黄素对单个结肠平滑肌细胞收缩的影响酶分离的单个结肠平滑肌细胞长度为240.25±23.47μm，向灌流液中加入大黄素可使其发生收缩，其效应与剂量大小呈正相关（EC50=15.56mM）。浓度为50μM的大黄素可使单个平滑肌细胞长度收缩为177.55 ± 22.5μm (n = 35, P<0.01)，而5 mM DIDS (223.45±21.68 μm, n=6)和100 μM niflumic acid (243.45± 22.12μm, n=6)可以阻滞这种作用。见图2。
2?3 结肠平滑肌细胞ClCa的家族基因表达分析以及大黄素对基因表达的影响检测ClCa 家族基因(ClCa1, 2, 3 and 4)mRNA的表达，在豚鼠近端结肠平滑肌细胞中表达有ClCa1和ClCa2基因的mRNA。相对荧光强度(ClCa mRNA / b?actin， %)检测提示ClCa1基因的mRNA表达强度是ClCa2基因的mRNA的5.3±0.71（n=5, P<0.01）倍。见图3A、B。
图1 大黄素增强离体结肠位相性收缩的作用（略）
图2 大黄素收缩单个结肠平滑肌细胞的作用（略）
ClCa1基因未用大黄素孵育时mRNA的相对荧光强度是20±6.3％，50μM大黄素孵育后的mRNA相对荧光强度是34.1 ± 2.8％，两者比较有明显改变（n=5, P<0.01）。见图6B、C。而ClCa2基因50mM大黄素孵育前mRNA的相对荧光强度是6.41 ± 1.1％，孵育后的mRNA相对荧光强度是5.32±1.3％，两者比较无明显改变（n=3, P>0.05）。见图3B。
3 讨论
以往的研究证实大黄素促进豚鼠结肠带平滑肌细胞的收缩活动，可能与增加细胞内钙离子浓度，抑制钾离子通道电流等相关［7］。然而ClCa通道是平滑肌组织中非常重要的，与收缩密切相关的离子通道，参与细胞膜电位的调节，兴奋氯离子通道可使细胞膜产生去极化，引起细胞和平滑肌收缩［8］。大黄素对结肠平滑肌ClCa通道的作用至今仍未见报道。在肌条实验中我们用10μM TTX预处理去除与神经元有关的作用后，大黄素可以增加离体结肠平滑肌肌张力（Tone）和自发性位相性收缩。氯离子通道拮抗剂DIDS（5 mM）和NFA（100μM）可以阻滞大黄素的作用［9］。由于有TTX不敏感的神经元细胞，为了进一步证明大黄素的作用是经过平滑肌细胞起作用，我们将大黄素直接加入急性分离的单个平滑肌细胞灌流槽发现可使平滑肌细胞产生明显的收缩，作用呈正相关的剂量效应关系。ClCa通道特异性拮抗剂NFA可以阻滞这种作用［10］。因此我们可推断，大黄素能通过兴奋钙离子依赖氯离子通道，引起结肠平滑肌收缩。分子生物学实验发现结肠平滑肌细胞中表达有ClCa1和ClCa2基因的mRNA［11］，并且以ClCa1基因的mRNA表达为主。50mM大黄素孵育后ClCa1基因的mRNA相对荧光强度明显增强，而ClCa2基因无明显改变。因而可推断大黄素促进结肠收缩的作用可能与其增强结肠平滑肌细胞ClCa1基因的mRNA表达相关。
图3 结肠平滑肌细胞表达ClCa 1 和 ClCa 2离子通道基因，且大黄素可增强ClCa 1基因的表达（略）
总之，大黄素可通过兴奋ClCa电流引起结肠平滑肌收缩。大黄素对ClCa电流兴奋作用与增强结肠平滑肌细胞ClCa1基因表达有关。
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