当归注射液对缺血再灌注损伤心肌细胞乳酸脱氢酶活性的影响
【摘要】 目的：观察当归对缺血再灌注损伤心肌组织中乳酸脱氢酶(LDH)活性，探讨当归抗心肌缺血再灌注损伤保护作用的机理。方法:将30只SD大鼠随机分成3组(每组n=10) :假手术组(Ⅰ组)、缺血再灌注组(Ⅱ组)和当归组(Ⅲ组) ,建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做组织化学染色，观察各组动物心肌细胞内乳酸脱氢酶(LDH)活性的变化。利用HPIAS?2000图像分析系统测定LDH在以上3组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：当归治疗组心肌细胞中乳酸脱氢酶(LDH)活性反应物呈颗粒状,均匀分布于肌膜下或肌丝区之间, 颗粒呈深紫色, 表示酶活性很强；假手术组酶反应物呈浅紫色细小颗粒状，肌膜下或肌丝区之间可见少量的紫色颗粒，分布较稀疏，表示酶活性较弱；缺血再灌注损伤组乳酸脱氢酶(LDH)反应物极弱，几乎未见酶活性表达。图像分析结果显示当归治疗组与假手术组和缺血再灌注损伤组之间乳酸脱氢酶(LDH)活性的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；假手术组与缺血再灌注损伤组之间乳酸脱氢酶(LDH)活性的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0.05)。结论：当归注射液对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞有重要的保护作用。
【关键词】 当归注射液； 缺血再灌注； 心肌； 乳酸脱氢酶(LDH)
目前虽然对缺血或缺血再灌注损伤的确切机制还不十分清楚,但已经知道损伤的临床结局主要就是细胞死亡。细胞死亡有两种形式:一种是坏死,另一种是凋亡。凋亡(apoptosis) 是细胞在基因调控下的主动性死亡,不引起炎症反应。持续缺血和缺血再灌注时心肌组织都可发生细胞凋亡。已经证实,人类心肌梗死除细胞坏死外,细胞凋亡也参与了梗死的病理过程,细胞凋亡不仅影响梗死面积,而且促成心脏结构的重构,心肌梗死的早期和晚期均存在凋亡现象。当归为伞形科植物当归Angelicasinennsis(Oliv.)Diels的干燥根，味甘、辛,性温，能补血和血,调经止痛,润燥滑肠。有报道［1］，当归对冠心病患者有平衡和抑制血小板聚集的作用，因而能明显改善胸痛、胸闷等临床症状和心电图缺血性ST?T 的变化, 是治疗冠心病的有效药物［2］。但当归对缺血再灌注损伤心肌细胞结构的影响，目前国内外未见报道。本研究采用组织化学方法，探讨当归抗心肌缺血再灌注损伤保护作用的机理。
1 材料与方法
1?1 动物模型制备及分组健康雄性SD大鼠（SPF级）30只,体重250～300g 左右，由武汉大学医学院动物试验中心提供。腹腔注射戊巴比妥钠4.5 mg·(100 g)-1 ,麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸（呼吸频率60次·min-1 ,潮气量2ml·(100g)-1,微型呼吸机由第二军医大学生产）,沿胸骨左缘第4 肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/ 开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成3组(每组n=15):假手术组(Ⅰ组) ,丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎；缺血再灌注组( Ⅱ组) ,缺血再灌注前5min 腹腔注射生理盐水0.8 ml·(100 g)；当归治疗组( Ⅲ组),缺血再灌注前5min 腹腔注射当归注射液0.8 ml·(100g)-1 。每组5只动物缺血30min再灌注40min ,10只动物缺血30min 再灌注120min。在缺血再灌注开始前, 经舌静脉注射伊文氏蓝, 缺血40min后心尖无蓝色且呈乌红部分为缺血区,再灌注120min 后心肌经TTC处理后心尖为白色部分为梗死区。
1?2 主要试剂 25%当归注射液(武汉大学中南制药厂,批号为970118)。
1?3 标本制作及观察① 取新鲜组织冰冻切片；② 切片入下液作用5～30min 0.5 M乳酸钠 6ml 1.5%乳酸脱氢酶水溶液 2ml 0.2M磷酸缓冲液pH7.4 10ml 蒸馏水 6ml③ 生理盐水稍洗；④ 10%甲醛盐水固定10min；⑤ 15%酒精稍洗1min；⑥ 生理盐水稍洗；⑦ 甘油明胶封片。
1?4 图像分析采用HPLAS?2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对酶活性表达进行定量分析,每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400),测定乳酸脱氢酶(LDH)每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
1?5 统计学处理用SPSS11.5软件对各组乳酸脱氢酶(LDH)反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和ＳＮＫ(ｑ)检验,检验水准α为0.05。
2 结果
2?1 光镜观察假手术组可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，但可见部分胞浆溶解；缺血再灌注损伤组见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，胞浆溶解呈空泡或网状，细胞界限模糊，可见心肌细胞断裂；当归组可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核呈椭圆形位于中央，胞浆内可见平行排列的肌原纤维，细胞轮廓清晰。
2?2 组织化学观察乳酸脱氢酶(LDH)活性 当归治疗组心肌细胞中乳酸脱氢酶(LDH)反应物呈颗粒状,均匀分布于肌膜下或胞浆内, 颗粒呈深紫色, 表示酶活性很强；假手术组肌酶反应物呈浅紫色细小颗粒状，可见少量的紫色颗粒，分布较稀疏，表示酶活性较弱；缺血再灌注损伤组乳酸脱氢酶(LDH)反应物极弱，几乎未见酶活性表达，表示无酶活性表达。经单因素方差分析,各组间的差异有显著性意义(P<0.05)，见表1。经SNK(q)检验, 当归治疗组与假手术组和缺血再灌注损伤组之间乳酸脱氢酶(LDH)活性的平均光密度及阳性面积率分别为：当归治疗组平均光密度0.3251±0.0528；假手术组平均光密度0.0986±0.0083；缺血再灌注损伤组平均光密度0.0872±0.0075。当归治疗组阳性面积率0.3913±0.0630； 假手术组阳性面积率0.0968±0.0074；缺血再灌注损伤组阳性面积率0.0871±0.0069。当归治疗组与假手术组比较平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；当归治疗组与缺血再灌注损伤组比较平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；假手术组与缺血再灌注损伤组之间比较平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。
表1 当归注射液对大鼠缺血/再灌注损伤心肌细胞内乳酸脱氢酶(LDH)活性影响的平均光密度和阳性面积率（略）
注: * 当归治疗组与假手术组比较,P<0.001;当归治疗组与缺血再灌注损伤组比较,P<0.05; ** 假手术组与缺血再灌注损伤组比较,P>0.05。
3 讨论
自1977年Hearse首次提出缺血再灌注损伤概念以来，已逐渐引起医学界的高度重视。大量动物实验显示，氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞、细胞黏附分子和细胞凋亡等均可能参与再灌注损伤的发病过程。目前虽然对缺血或缺血再灌注损伤的确切机制还不十分清楚,但已经知道损伤的临床结局主要就是细胞死亡。已经证实,人类心肌梗死除细胞坏死外,细胞凋亡也参与了梗死的病理过程,细胞凋亡不仅影响梗死面积,而且促成心脏结构的重构,心肌梗死的早期和晚期均存在凋亡现象［3］。缺血再灌注损伤对心肌组织的结构和功能的影响一直是研究的重点之一。当归的药用价值早已为人们所认识, 从当归的乙醇提取物中分离到6种化合物分别为: (E)?藁本内酯、(Z)?藁本内酯、 (Z)?正丁基呋内酯、棕榈酸、 B2谷甾醇、 阿魏酸。此外还含有蔗糖、多种氨基酸及微量金属元素、烟酸、 丁二酸、 腺嘌呤、 尿嘧啶、 胆碱等成分。当归的药理作用主要是：①促进机体免疫；②对呼吸系统的作用；③对血液循环系统的作用。有报道［4，5］， 当归对冠心病患者有平衡和抑制血小板聚集的作用，因而能明显改善胸痛、胸闷等临床症状和心电图缺血性ST?T 的变化, 是治疗冠心病的有效药物［6］。当归具有钙通道阻滞作用, 拮抗钙超载, 对心肌缺血再灌注所致心肌损伤有保护作用。在缺血及再灌注状态下, 心脏顺应性及射血功能得到良好的保护, 使反映心肌损伤程度的CPK 活性和氧自由基损伤过程产生的过氧化脂质分解产物MDA 的浓度大大降低［7］。本实验通过结扎/松解左冠状动脉前降支复制心肌缺血再灌注模型，并用当归注射液预处理，通过组织化学方法显示乳酸脱氢酶(LDH)活性，结果显示当归治疗组心肌细胞中乳酸脱氢酶(LDH)活性很强，假手术组心肌细胞中乳酸脱氢酶(LDH)活性较弱，缺血再灌注损伤组乳酸脱氢酶(LDH)酶活性极低。经统计学分析处理，当归治疗组与假手术组比较平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；当归治疗组与缺血再灌注损伤组比较平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；假手术组与缺血再灌注损伤组之间比较平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。有文献报道心肌缺血30min在超微酶细胞化学水平便可显示SDH和LDH活性的降低，以后随缺血时间的延长，改变更加明显，直至酶染颗粒完全消失。我们的实验也已证明了这一点。通过实验表明：当归注射液预处理提高了心肌酶的活性并维持了细胞超微结构的完整性，对缺血再灌注心肌细胞有保护作用。其保护作用可能机制是：①改善心肌收缩功能，增加能量储备：当归注射液具有心肌抑制效应，可以降低心肌耗氧量，增加氧供需比，有利于心肌储存较多的能量。缺血后，心肌首先动用储备的ATP和氧，由于当归注射液提高了心肌的能量储备，ATP下降缓慢，无氧酵解推迟发生，而且能够对抗氧自由基对心肌的损伤，保护了线粒体的功能；更重要的是能够保存缺血期ATP分解的底物，从而为再灌后心肌合成ATP提供原料，促进能量代谢的恢复。②增加冠脉流量：主要扩张小冠状动脉，增加心肌冠脉血流、增加心肌氧供。③减少灌注期间自由基的释放：当归注射液可以促进缺血后心肌超氧化物岐化酶（superoxide dismutase,SOD）活性的恢复，抑制丙二醛生成，减少氧自由基的生成，减轻对心肌的损害。④减少钙离子内流：当归注射液可减少缺血后细胞内钙离子浓度。它抑制钠/钙交换，并于L?型钙通道结合，减少钙内流，储存在肌浆网中的钙离子通过开放理阿诺碱受体钙释放通道复合体，钙离子流向细胞外，而使细胞内钙减少，促进心肌的功能性恢复，减少心肌梗死面积。从以上的实验结果和讨论来分析当归注射液为防治缺血再灌注损伤的应用具有重要的研究意义，并且为加强心肌保护作用提供了重要的理论依据。
【文献】
1 Komai H , Rusy BF?Effects of inhibition of transsar colemmal calciam inlux by nickel on force of postrest contraction on contracture inducde by rapid colling. Cardiovase Res , 1993, 27:801?
2 Kark M , Ziemer G, Zoeller M，et al . Protection of the chronic hypoxic immature rat heart during globalischemia. Ann Thorac Surg ,1995 , 59 : 699?
3 徐新春.钙超载与心肌缺血再灌注损伤. 心血管病学进展,2000 ,21 (4) : 227?
4 Das DK, Neogi A. Effects of superoxide anions the Na+?K+?ATP system in rat lung. Clin Physiol Biochem,1984 , (2) :32?
5 戴瑞鸿,李勇,范维琥，等. 保护内皮细胞功能在防治心血管疾病中的重要性. 国际心血管杂志,2000 ,2 (4) : 328?
6 谢志泉. 细胞凋亡与缺血性心脏病. 心血管病学进展,1999 ,20(5) :279?
7 Olivetti G,Abbi R ,Quaini F， et al?Apoptosis in the failing humanheart.N Engl J Med ,1997,336:1131?
