枸杞延缓小鼠皮肤老化的实验研究
作者：张华 于学文 杨学东 白秀珍
【摘要】 目的： 探讨枸杞延缓皮肤老化作用及其作用机制。方法： 昆明种小白鼠颈部注射D?半乳糖，复制亚急性衰老模型。用黄嘌呤氧化酶法测定皮肤SOD活力，用硫代巴比妥酸（TBA）法测定皮肤MDA的量，用碱水解法测定皮肤HOP含量，用HE染色法观察皮肤组织形态学改变。结果：给药组小鼠皮肤SOD活性明显增加，MDA含量明显降低，胶原蛋白含量明显增加，皮肤组织形态学检查结果与衰老模型组比较显示真皮层成纤维细胞数量增加，胶原纤维排列紧密，排列较规则。结论： 枸杞可以延缓皮肤老化，浓度低于20%时其作用随剂量增加而增强，当浓度高于20%时其延缓老化作用随剂量增大而减弱。
【关键词】 枸杞水煎剂； 皮肤老化； D?半乳糖； SOD； MDA； HOP
皮肤老化是整个机体衰老在皮肤上的反应，随着年龄的增加，衰老的最直观的变化即为皮肤。皮肤衰老不仅有损于美容，且与许多皮肤病如脂溢性角化、日光性角化、基底细胞癌、鳞状细胞癌的发生也有着病因学的关系。因此，预防和延缓皮肤衰老已成为生命研究的热点之一。本研究观察了外用枸杞水煎剂对D?半乳糖所致亚急性衰老模型小鼠皮肤的作用，为中医药化妆品提供基础资料。
1 材料
1?1 药品外用枸杞水煎剂的制备: 取宁夏枸杞子100g，用四分法将其缩减至50g，60℃干燥后粉碎，称取40g粉末加10倍量80%乙醇冷凝回流提取2次，每次1h（保持微沸），8层纱布过滤；将药渣加8倍量水继续冷凝回流提取3次，每次1h（保持微沸），收集滤液；合并3次滤液，于旋转蒸发仪上浓缩至50ml。分别取一定量稀释至所需浓度(1%、10%、20%、40%、80%)，加入一定量的氮酮（Azone）使氮酮浓度达到3%，备用。SOD、MDA、HOP试剂盒、考马斯亮蓝液均购于南京建成生物研究所;D?半乳糖购于amresco公司;宁夏枸杞购于辽西国药店;其它试剂均为国产分析纯。
1?2 实验动物昆明小白鼠80只月龄，雌雄各半，体重26～30g，购自辽宁医学院实验动物中心。
1?3 仪器UV751?GD型紫外可见分光光度计（上海欣益仪器仪表有限公司）；脱水机、包埋机、切片机、染色机（英国SHANDON公司） ；旋转蒸发仪RE?52（上海安亭仪器厂）；FDV高速风选式超细粉碎机（佑崎机械制造公司）；高速离心机（上海手术仪器厂）；电热恒温水浴箱（北京光明医疗仪器厂）；XH?B型旋涡混匀器（姜堰市康健医疗器具有限公司）；BS223S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。
2 方法
2?1 实验动物分组昆明小白鼠随机分成8组，每组10只，自由食水1w后, 背部剃毛2×2cm区域，以后每5天剃毛一次。按照表1给予处理因素,连续50d。
表1 实验动物分组（略）
2?2 取材末次给药后将受试区域的被毛彻底剃干净，乌拉坦(1.5g/kg)麻醉取皮肤。
2?3 生化指标的测定
2?3?1 皮肤SOD 、MDA含量的测定 0℃的生理盐水中去除皮下脂肪，滤纸拭干，按1：9的比例制生理盐水相皮肤匀浆液，3000rpm离心15min，取上清备用，按试剂盒说明进行操作。
2?3?2 皮肤HOP含量的测定 乙醚消化皮下脂肪，滤纸拭干，按照试剂盒说明，碱水解法测皮肤HOP含量。
2?4 组织学观察取受试皮肤，10％福尔马林固定，常规石蜡切片，HE染色，普通显微镜下进行组织学观察。
2?5 数据处理数据以均数±标准差表示，组间比较用单因素方差分析。
3 结果
3?1 皮肤SOD 、MDA含量
表2 皮肤SOD 、MDA含量（略）
注：与对照组比较, #P<0.01；与衰老组和氮酮组比较,*P<0.05，**P<0.01。
3?2 皮肤HOP含量及胶原蛋白含量
表3 皮肤HOP含量及胶原蛋白含量（略）
注：与对照组比较, #P<0.01；与衰老组和氮酮组比较,*P<0.05，**P<0.01
图1 对照组 （×400）（略）
图2 衰老组（×400）（略）
图3 给药Ⅲ组（×400）（略）
3?3 皮肤形态学观察衰老组(图2)与对照组(图1)比较，胶原纤维染色减弱，纤维变细且排列稀疏，表明胶原纤维合成减少；表皮厚度变薄，角质层变厚。给药Ⅲ组(图3)与衰老组(图2)比较，胶原纤维合成较模型组明显增加，表皮厚度增厚，角质层变薄；真皮层成纤维细胞数量增加。
4 讨论
老年动物饲养周期长，个体差异大，不易获得。而青年小鼠长期注射D?半乳糖，由于其代谢产物半乳糖醇不能被进一步代谢而堆积在细胞内，影响渗透压，导致细胞肿胀，代谢紊乱，体内活性氧水平升高，细胞脂质受损，以致产生机体多器官、多系统的功能减退，这些变化均与老龄小鼠相似。故本实验采用了D?半乳糖所致的小鼠衰老模型［1］。由表2、表3可知，连续颈部注射D?半乳糖50d后,其皮肤SOD值与对照组比较明显降低(P<0.01),MDA值与对照组比较明显升高(P<0.01);胶原蛋白含量明显增加(P<0.01)。由图2和图1比较可知胶原纤维染色减弱，纤维变细且排列稀疏；表皮厚度变薄，角质层变厚。表明衰老模型制造成功。氮酮是近年来应用较为普遍的一种透皮吸收促进剂。其特点是无色无臭，对人体粘膜产生最低刺激，有效浓度低，对亲水亲油性药物均有促进作用。它是通过增加角质层类脂流动和溶解皮肤的类脂来增加药物的透皮吸收［2］。本实验在不同浓度的枸杞水煎剂中加入3％的促渗剂氮酮，使药效得到充分发挥。皮肤老化是机体衰老的外在反映，机体的衰老源于细胞的衰老。关于皮肤的衰老学说有很多，1956年，Harman D［3］提出了衰老的自由基学说，该学说认为衰老是由于自由基引起的对细胞成分的进攻造成的结果，维持体内适当水平的抗氧化剂和自由基清除剂水平，可以延长寿命和推迟衰老。自由基具有极强的氧化能力，可使生物膜中不饱和脂类发生过氧化，形成过氧化脂质，其终产物MDA是强的交联剂，与蛋白质、核酸或脂类结成难溶性物质，使生物膜硬化导致通透性降低，影响细胞物质交换，继而使之破裂、死亡。而SOD是最有效的抗氧化剂和自由基清除剂，SOD的活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。本实验给药组皮肤SOD值明显高于衰老组(P<0.01)，MDA值明显低于衰老组(P<0.01)，提示枸杞水煎剂能够激活内源性防御自由基损伤的物质,抑制自由基。皮肤由表皮和真皮组成。表皮的基底层细胞不断地进行细胞分裂，分裂后的细胞不断地分化为其他各种表皮细胞，最后形成角质层细胞。随着年龄增加，基底层细胞的分裂速度降低，导致表皮中老化的细胞增多，角质层增厚和表面较粗糙等表皮老化现象。由图3可知，给药组的角质层与表皮厚度的比例小于衰老组，这一结果证明枸杞水煎剂外用能使基底层细胞进行细胞分裂,使表皮的角质层细胞以外的其他细胞延缓分化为角质细胞，从而使表皮延缓衰老。胶原纤维是真皮中的主要成分之一，具有支持、连接等作用。胶原纤维的主要成分是胶原蛋白，对维持皮肤的张力和弹性起重要作用。羟脯氨酸是胶原蛋白的特征性氨基酸，约占胶原蛋白全部氨基酸残基的13.4％。随着年龄增加，体内SOD等清除自由基能力下降，自由基大量增加可引起胶原蛋白交联、老化、失去弹性。本实验显示，枸杞外用可使胶原纤维的体密度增加，从形态学的角度证明了枸杞外用能使真皮的胶原纤维更新，它较生化指标的测定具有更直接、客观的实际意义。综上所述，枸杞水煎剂对皮肤有延缓衰老作用,其作用可能是通过下列途径进行：增强和调节机体免疫功能，激活内源性防御自由基损伤的物质SOD，抑制自由基；对表皮是通过刺激表皮细胞分裂进行的；对真皮通过作用于成纤维细胞和微血管，增加胶原蛋白合成，从而延缓皮肤衰老。
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1 龚国清,徐磅本. 小鼠衰老模型研究. 药科大学学报，1991，22（2）：101?
2 胡晋红, 陈岗, 朱宇. 药物透皮吸收促进剂及其联合应用. 国外医学.药学分册,1996,23(2) :105?
3 Harman D.Aging:A theory based on free radical and radical and radiation chemistry. JGeron,1956,11(3):298~300.
