HPLC法测定清火栀麦片中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量

赵保华，贺秀霞，徐丽珍*，杨世林                                                                                【摘要】  目的  建立清火栀麦片中对穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯测定的HPLC法。方法  外标法，DiamonsilTMC18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）;流动相：甲醇-0.4%冰醋酸水溶液（46：64）；检测波长225nm和250nm；流速1ml/min。结果  穿心莲内酯的线性范围为0.112～0.391μg（r=0.9997），平均回收率为99.8%，RSD=1.8% (n=5)；脱水穿心莲内酯的线性范围为0.221～0.773μg (r=0.9996)，平均回收率为98.7%，RSD=0.5% (n=5)。结论  方法准确、灵敏，可作为清火栀麦片中穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯的定量分析方法。
   
    【关键词】  片剂；穿心莲内酯；脱水穿心莲内酯；高效液相色谱
    
    【Abstract】  Objective  To determine the content of andrographolide、dehydroandrographolide in Qinghuozhimai tablets by HPLC. Methods  An external standard method by HPLC with DiamonsilTMC18 column as fixed phase and methanol-0.4%HAC(46:64) as mobile phase was adopted. The detection wavelength was 225nm、250nm and the flow rate was 1.0ml/min.Results  The linear range for andrographolide was 0.112～0.391μg(r=0.9997).The average recovery of tablets sample was 99.8% and RSD was 1.8% (n=5);the linear range for dehydroandrographolide was 0.221～0.773μg(r=0.9996). The average recovery of tablets sample was 98.7% and RSD was 0.5% (n=5).Conclusion  The method is simple and accurate， which can be adoptable for quantitative analysis of andrographolide、dehydroandrographolide of Qinghuozhimai tablets.
   
    【Key words】  tablets; andrographolide;dehydroandrographolide;HPLC
   
    清火栀麦片［1］是由穿心莲［2］、栀子、麦冬三味药经提取精制而成，具有清热解毒，凉血消肿等功效，主要用于咽喉肿痛、发热、牙痛、目赤等。但其质量标准无两种有效成分的同时测定方法［3～5］。为完善质量控制标准，本文选择采用穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯作为测定对象，建立了用HPLC同时测定清火栀麦片中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的方法。
   
    1  仪器、试剂和样品
   
    Waters高效液相色谱仪，600型泵，996型紫外检测器，million2010数据处理系统。
   
    甲醇（色谱纯），冰醋酸（分析纯），水为重蒸水；清火栀麦片由江西汇仁集团提供。穿心莲内酯（0797-200105）、脱水穿心莲内酯（854-9902）对照品由药品生物制品检定所提供，经高效液相色谱法归一化法测定纯度为99.5%和99.0%。
   
    2  方法与结果
   
    2.1  色谱条件  色谱柱DiamonsilTM（钻石），C18，150mm×4.6mm，5μm;流动相：甲醇-0.4%冰醋酸水溶液（46：64）；流速1ml/min；柱温25℃。检测波长225nm和250nm。
   
    2.2  样品制备及方法可行性考察
   
    2.2.1  对照品溶液  取穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品适量，精密称定，甲醇溶解，制成浓度为穿心莲内酯20μg/ml和脱水穿心莲内酯50μg/ml的混合对照品溶液，备用。
   
    2.2.2  样品溶液制备  取本品20片，除去糖衣，研细，混匀。取粉末约0.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇20ml，超声处理30min，放置至室温，用甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
   
    2.2.3  阴性样品溶液制备  另取不含穿心莲药材的阴性样品*［*不含穿心莲药材的阴性样品：按清火栀麦片配方（删除穿心莲药材），采用该片剂制备工艺制得的样品］，照供试品溶液项下操作制备成阴性样品溶液。
   
    2.2.4  测定方法  分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液10μl注入HPLC仪，绘制色谱图，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的理论塔板数均不小于4000。样品中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯与相近峰分离清晰完全，穿心莲内酯分离度为1.5，脱水穿心莲内酯分离度为2.0。且阴性样品在相同位置无干扰。见图1。
 
              
  
                    图1  对照品样品及阴性对照品的HPLC图谱

2.3  线性关系考察  分别精密吸取穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯混合对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，分别置10ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，混匀。穿心莲内酯对照品溶液浓度分别为11.16、16.74、22.32、27.90、33.48、39.06μg/ml，脱水穿心莲内酯对照品溶液浓度分别为22.08、33.12、44.16、55.20、66.24、77.28μg/ml，分别取10μl注入HPLC仪。以峰面积为纵坐标，对照品量为横坐标，绘制标准曲线，回归方程分别为：穿心莲内酯：Y=2.19×１０６X-5.84×１０４，r=0.9997；脱水穿心莲内酯：Y=1.53×１０６X-5.10×１０３，r=0.9996。线性范围：穿心莲内酯：0.112～0.391μg；脱水穿心莲内酯：0.221～0.773μg。
   
    2.4  仪器精密度和样品稳定性、重现性试验  在相同色谱条件下，分别精密吸取穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品的混合溶液10μl，注入HPLC仪，重复进样5次，测定对照品溶液峰面积积分值，结果见表1。

    同一供试品溶液每次取10μl，每隔1h进样，共进样5次，测定峰面积积分值，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰面积RSD分别为1.4%和0.8%，结果表明，样品在5h内稳定。见表2。

                        表2   稳定性试验测定结果

      
        
    同一批样品5份，精密称定，按“样品溶液制备”项下操作，制备成供试品溶液，每份样品各进样10μl，测定穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量，其平均穿心莲内酯含量为0.0731%，RSD=1.1%；脱水穿心莲内酯含量为0.321%，RSD=0.6%。结果见表3。

                          表3  重复性试验测定结果

          
    
    2.5  回收率试验  精密称取已知含量的样品5份，分别精密加入一定量的穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品，按样品溶液制备和测定方法项下操作测定，结果穿心莲内酯平均回收率为99.8%，RSD=1.8%；脱水穿心莲内酯平均回收率为98.7%，RSD=0.5%(n=5)。测定结果见表4、5。

                  表4  穿心莲内酯回收率试验测定结果

                    表5  脱水穿心莲内酯回收率试验测定结果

       
   
    2.6  样品测定  按样品溶液制备项制备供试品溶液后，精密吸取供试品溶液10μl，按上述色谱条件测定，用外标法清火栀麦片中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯含量，结果见表6。

         表6  清火栀麦片（糖衣）中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯含量  （n=5）

     
    
    3  讨论
   
    3.1  穿心莲  为本方君药，穿心莲主要成分为穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯。本方法选择穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯为检测成分，共检测了10批成品的含量，结果表明该方法稳定可行，方法简便准确。
   
    3.2  样品制备的最佳选择  (1)提取溶剂的选择:分别用甲醇、无水乙醇、95%乙醇作为提取溶剂进行了提取，检测结果表明，甲醇提取效果最好。(2)提取时间的选择：采用超声方法进行提取，选择不同时间提取后，进行检测，结果表明30min即可提取完全。
   
    3.3  方法评析  本方法准确灵敏，可作为清火栀麦片中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的定量分析方法，为进一步制定清火栀麦片质量标准提供了依据，并对含有穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的其他产品的检测也具有一定的价值。

【参考】

    1  中华人民共和国卫生部药品标准.中药成方制剂，第13册.WS3-B-2617-97.
    2  国家药典委员会.中华人民共和国药典.2000年版(一部).北京：化学出版社，2000，220-221.
    3  屈喜玲.穿心莲浸膏胶囊中脱水穿心莲内酯的含量测定.中药材，2000，23(6):353-354.
    4  黄捷.清火栀麦胶囊中穿心莲内酯的HPLC测定及稳定性考察.应用药学杂志，2000，17(3):227-229.
    5  金海英，周秀芳，徐慧，等.穿心莲药材中穿心莲内酯的含量测定.中医药信息，2001，18(6):27.