枸杞多糖诱导雄激素不依赖型人前列腺癌细胞凋亡及相关基因表达的研究

               作者：李卓能，罗 琼，杨明亮，闫 俊，庞雅琴，姜 鸣

    【摘要】  目的  研究枸杞多糖对诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡及相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法  体外培养的人前列腺癌PC-3细胞经枸杞多糖作用后，采用MTT法测定细胞的增殖情况。采用TUNEL观察PC-3细胞凋亡的变化，用免疫组化法检测其Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果  一定剂量的枸杞多糖可明显抑制PC-3细胞的生长，并能诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡，凋亡率为41.5%，同时PC-3细胞Bcl-2/Bax蛋白比值显著下降，呈明显的剂量/效应关系。结论  枸杞多糖能诱导人前列腺癌PC-3细胞的凋亡，其机制与调节人前列腺癌PC-3细胞Bcl-2和Bax蛋白表达有关。
   
    【关键词】  枸杞多糖；人前列腺癌细胞；细胞凋亡；Bcl-2；Bax
    
    【Abstract】  Objective  The aim of this study was to investigate the influence of Lycium barbarum polysaccharides (LBP) on human prostatic cancer cell line PC-3 and its Bcl-2 and Bax expression.Methods  We cultured human prostate cancer PC-3 cell in vitro and added the LBP to the medium at different concentrations. the MTT assay was used to measure the proliferation of PC-3 cell. TUNEL was used to investigate the effects of LBP on PC-3 cell apoptosis and immunohistochemical technique was used to detect the Bcl-2 and the Bax expression.Results  LBP could inhibit the growth of PC-3 cell line. LBP can induce apoptosis and the apoptosis rate is 41.5%，the ratio of Bcl-2/Bax protein decreased significantly with a dose-effect relationship.Conclusion  LBP inhibits PC-3 cell line independent of androgen in vitro， and the mechanisms may be related to its influence on the cell cycle and inducing of apoptosis.
   
    【Key words】  lycium barbarum polysaccharide；human prostatic cancer cell；apoptosis；Bcl-2；Bax
   
    随着水平的提高，生活方式的改变和人均寿命的延长，前列腺癌的发病率有日益增多的趋势［1］，我国前列腺癌的发病率约为2.41/10万男性人口［2］。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）是枸杞子（Fructus Lycii）的提取物，具有多种药理作用和生物活性功能［3］及抗肿瘤功能［4］，并能诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡从而抑制其增殖［5］。然而其诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡的机制还不明了。本文拟进一步探讨枸杞多糖对人前列腺癌PC-3细胞凋亡及相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响，以探讨枸杞多糖抗前列腺癌的可能机制。
   
    1  材料与方法
   
    1.1  试品及试剂
   
    1.1.1  枸杞多糖  由本实验室制备。
   
    1.1.2  细胞株及培养条件  雄激素不依赖型人前列腺癌细胞株PC-3由华中科技大学同济医学院提供，在含体积分数为10%的小牛血清中加入双抗的F12培养液(Ｇｉｂｃｏ)，37℃，5%CO2培养。
   
    1.2  方法
   
    1.2.1  实验分组及处理  实验设1个空白对照组和5个不同浓度实验组，分别为LBP 100μg/ml、LBP 200μg/ml、LBP 400μg/ml、LBP 800μg/ml和LBP 1000μg/ml。取对数生长期的PC-3细胞1×104个/ml接种于25ml的培养瓶培养， 24h后加入前述不同浓度的LBP，作用48h后，胰酶消化离心，将细胞悬浮于PBS中，调浓度为1×106个/ml细胞悬液，备用。
   
    1.2.2  原位末端标记法(TUNEL)  由武汉博士德公司提供TUNEL检测试剂盒。光镜下，胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。随机计数200个细胞，算出阳性细胞率。
   
    1.2.3  Bcl-2和Bax蛋白检测  按成套Bcl-2和Bax蛋白免疫组化染色试剂盒(武汉博士德公司)说明操作。光镜下观察胞浆、胞膜出现棕褐色的为阳性细胞，随机计数200个细胞，算出阳性细胞率。
   
    1.3  数据统计  所有的数据均用x±s表示，采用SPSS软件包分析数据，各组间指数的比较采用单因素方差分析和t检验。
   
    2  结果
   
    2.1  枸杞多糖对人前列腺癌PC-3细胞生长的抑制作用  不同浓度的枸杞多糖对体外培养的PC-3细胞有抑制作用，并随剂量的增加其抑制作用加强，最大抑制率可达到87.84%。100μg/ml与200μg/ml组，与对照组比较差异有显著性P＜0.05；400μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml组，与对照组比较差异有非常显著性P＜0.01，结果见表1。

表1  枸杞多糖对人前列腺癌细胞PC-3细胞增殖的抑制作用  （x±s） 

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01 

    2.2  原位(缺口)末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡  形态学观察见TUNEL阳性细胞及凋亡细胞核染呈棕褐色，具有典型凋亡特征，表现为细胞缩小、核浓缩、核碎裂等。对照组的凋亡细胞明显少于实验组细胞。由表2可知，实验组PC-3细胞凋亡率明显比对照组高(P<0.01)；其中1000μg/ml组的凋亡率最高（41.5％）。

表2  枸杞多糖对PC-3细胞凋亡作用TUNEL检测结果 

注：与对照组比较，*P＜0.01

    2.3  凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的检测  Bcl-2、Bax阳性表达的细胞可见明显的黄棕色细胞轮廓及黄染的胞浆。各实验组的凋亡抑制蛋白Bcl-2表达均比对照组低，而促凋亡蛋白Bax的表达比对照组强。由表3可更清楚的知道Bcl-2和Bax蛋白表达的变化：与空白对照组相比，各剂量组Bcl-2阳性反应物强度明显降低，染色变浅（P＜0.01）。对照组的Bax表达最弱，与各枸杞多糖实验剂量组差异明显（P＜0.01）。

表3  枸杞多糖对PC-3细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 

注：与(1)比较，*P＜0.01

    3  讨论
   
    近10年来，国内外学者的大量研究证实，多糖可影响肿瘤的发生与，具有抗癌、抗突变作用［6］，有的多糖如银耳多糖、香菇多糖等，已成为国际上评价最高的抗癌药之一［7］。前列腺癌已经成为最常见的男性恶性肿瘤［8］，根治前列腺癌的关键在于抑制癌细胞［9］。肿瘤的发生和发展是一个复杂的多阶段的过程，实际是多种肿瘤相关基因表达失常或许多肿瘤抑制基因失活所致。这类基因的主要功能是参与细胞增殖、分化和衰亡即凋亡等基本生命过程的调控。当这类基因由于某种原因发生突变、重排、缺失、扩增而被异常激活或失活时，正常的受控增殖、分化或凋亡受到干扰，于是细胞无限增殖、分化受阻或寿命延长而形成肿瘤。因而研究肿瘤细胞中基因的变化，有助于从分子水平了解细胞癌变机制。凋亡抑制基因bcl-2及其表达蛋白能够抑制或阻断多种因素引起的细胞凋亡，而促凋亡基因bax是bcl-2家族的一个重要成员，恰恰与bcl-2有相反的生物效应，它的显著表达能促进细胞体的凋亡。在体内Bcl-2、Bax蛋白可形成异质二聚体，两者剂量的比率决定细胞凋亡的敏感性，当Bcl-2/Bax增大则细胞存活，反之则易凋亡［10，11］。
   
    本研究的结果表明Bcl－2/Bax蛋白表达比值越小的组凋亡越明显，且表现出明显的剂量依赖性。可以认为枸杞多糖可能是通过调节Bcl－2和Bax蛋白的表达而诱导肿瘤细胞的凋亡，进而起到了抗肿瘤的作用的。但LBP是通过什么途径影响Bcl-2和Bax的表达，需要进一步研究。

【】

    1  Gu FL， Xia TL， Kong XD. Preliminary study of the frequency of benign prostatic hyperplasia and prostate cancer in China. Urology， 1994，44：688-691.    
    2  鲍镇美. 前列腺癌的.中华泌尿外科杂志，1997，5：315-320.    
    3  薛立文，李以暖. 枸杞子的营养和保健功能.广东微量元素，2000，7（6）：1-4.    
    4  甘璐， 张声华.枸杞多糖的抗肿瘤活性和对免疫功能的影响.营养学报，2003，6：200-202.    
    5  李卓能，罗琼，杨明亮，等.枸杞多糖对人前列腺癌细胞生长的抑制作用.中华中西医杂志，2005，1：5-6.    
    6  J Han.Highlights of the cancer  chemoprevention  studies  in  china. Preventive Medicine，1993，22：712.    
    7  千原吴郎. 抗癌剂の现状と将来特に生药药理の观点かさ.药学杂志，1988，108（3）：171.    
    8  Garnick MB.Prostate cancer： screening， diagnosis， and management. Ann Intern Med，1993，118：804-818.    
    9  Chodak GW.Single agent therapy with bicalutamide： A comparison with medical and surgical castration in the treatment of advanced prostate cancer.Urology，1995，46：849.    
    10  屈纪富， 程天民， 许霖水.放创复合伤皮肤伤口成纤维细胞凋亡变化及其机理研究.中华放射医学与防护杂志，2002，22：155-158.    
    11  Saxena A，Moshynska O， Sankaran K，et al. Association of a novel single nucleotide polymorphism， G(-248)A， in the 5′-UTR of BAX gene in chronic lymphocytic leukemia with disease progression and treatment resistance. Cancer Letters，2002，187：199-205.