破除南方红豆杉种子休眠方法的研究
作者：熊耀康 谢志慧 张春椿 李效贤 杜玲玲 詹敏
【摘要】 目的］研究南方红豆杉种子休眠机理，探究其最佳破除休眠方法。［方法］采用流水法、激素法、变温层积法、激素加变温层积法等对南方红豆杉种子进行破除休眠，通过比较处理后种子水提液对油菜种子发芽率抑制情况，来确定最佳破除休眠方法。［结果］通过四种方法处理过的南方红豆杉种子水提液对油菜种子的发芽率抑制情况比较，结果表明激素加变温层积法的抑制程度最低。［结论］最佳破除休眠的方法为以0.05%赤霉素处理辅以低（4℃）?暖（23℃）?低（4℃）变温层积法处理120天。
【关键词】 南方红豆杉；种子；休眠；层积 南方红豆杉（Taxus mairei(Lemee et Levl.)S.Y.Hu ex Liu）系裸子植物亚门、松杉纲、红豆杉目、红豆杉科中红豆杉族下属的红豆杉属植物。该属植物全世界有11种，均分布于北半球温带。我国产4种1变种［1］。红豆杉属植物，是第四纪遗留下来的世界珍稀濒危物种之一，属国家一级保护植物，素有“植物黄金”之称。据记载红豆杉属植物枝叶具通经止痛、利尿、降血糖作用［2］。上世纪70年代，Wani等人从短叶红豆杉(Taxus brevlfolia)中提取分离得到天然抗癌药物——紫杉醇（Taxo1）［3］。紫杉醇是非常有效且安全的抗癌药物，对卵巢癌、乳腺癌、白血病、肺癌及结肠癌等疗效显著，在使用其它抗癌药无效时，紫杉醇能有较好的疗效［4］。在出口“创汇”的诱惑力影响下，国产红豆杉属植物大面积被砍伐。再加之该属物种在界多以偶见种形式存在，自然繁殖更新能力较低，目前已处于濒危状态，故研究、保护、拯救红豆杉属植物并保存其种质遗传多样性是刻不容缓的。南方红豆杉为红豆杉属植物在分布最广泛的一种［5］，将其野生植物引种驯化，进行人工栽培，建立规范化生产基地，是对野生资源保护、实现野生植物资源的可持续开发利用最有效的途径之一。调查发现［6］，南方红豆杉种子具深度休眠，在自然条件下种子需要一两年才能萌发，在这漫长的休眠期间里大量种子丧失了生命力，即使将种子含水量降到最低,贮藏温度很低的条件下,种子的寿命仍然较短。种子深度休眠直接影响了其天然更新能力和群体数量,威胁到这一物种的种群生存和。可见,对野生南方红豆杉种子休眠机理进行研究,找到快速解除休眠的方法,对于提高南方红豆杉的繁殖系数,保护野生南方红豆杉资源,挽救濒临灭绝的红豆杉属植物物种及遗传多样性保护具有重要意义。
1 仪器与试药
仪器：PYX?DHS?40×50隔水式电热恒温培养箱（上海市跃进医疗器械厂）；LDZ5?2型低速自动平衡离心机（北京医用离心机厂）。试药：赤霉素（080104，上海伯奥生物科技有限公司）。南方红豆杉种子采自桐庐金竹岭南方红豆杉自然保护小区，经浙江省食品药品检验所鉴定为（Taxus mairei(Lemee et Levl.)S.Y.Hu ex Liu）。油菜(Brassica campestris L.)种子购自浙江省种子总站。
2 实验方法
2.1 种子处理方法（1)流水法 取一定量南方红豆杉种子放置尼龙网布，用流水冲洗1周。(2)激素法：取一定量南方红豆杉种子用0.05%赤霉素浸泡24h。(3)变温层积法：取一定量南方红豆杉种子放入蒸馏水中浸种24h，然后用含水量10%的湿沙混合，放置4℃冰箱沙藏40d，每隔5d翻动检查一次，保持种子湿润。然后移至23℃恒温室沙藏50d，最后再进行4℃低温沙藏30d。(4)激素加变温层积法：取一定量南方红豆杉种子用0.05%赤霉素浸泡24h，然后用含水量10%的湿沙混合，放置4℃冰箱沙藏40d，每隔5天翻动检查一次，保持种子湿润。然后取出，筛掉沙子，薄层阴干，用0.05%赤霉素浸泡24h，移至23℃恒温室沙藏50d，最后，再进行4℃低温沙藏30d，低温沙藏之前同样需要用激素浸泡。
2.2 检测方法与数据统计 分别称取经上述四种方法处理过的及未处理过的南方红豆杉种子各5.0g，用蒸馏水研磨成匀浆，离心，上清液定容至10mL，即得0.5g/ml的种子水提取液。以油菜(Brassica campestris L.)种子发芽率判定抑制物活性，将油菜种子(每份50粒)置于垫有滤纸的培养皿中，将南方红豆杉种子水提取液稀释成含有0.5、0.25、0.1、0.05、0.025g/mL南方红豆杉种子水提液的浓度系列(Ci)，分别量取2mL加入到铺有油菜种子的培养皿中，每一浓度作3份重复，检测油菜种子发芽率及幼根生长情况，另以蒸馏水代替水提取液作对照组。按下式每一浓度南方红豆杉种子水提取液Ci对油菜种子的发芽抑制率Ri：
Ri=Go-GiGo×100%
式中Ri为南方红豆杉种子某一水提取液浓度Ci对油菜种子的发芽抑制率，Go为对照组(蒸馏水)油菜种子发芽率，Gi为南方红豆杉种子某一浓度水提取液Ci对油菜种子的发芽率。
3 实验结果
采用上述四种方法处理过的及未处理过的南方红豆杉种子的水提液对油菜种子萌发的情况分别见表1、2、3、4、5，与对照组比较，结果表明：不同浓度南方红豆杉种子的水提液对油菜种子发芽都有不同程度的抑制作用；四种方法中，激素加变温层积法是解除种子内发芽抑制物质的最佳方法。
表1 流水法处理南方红豆杉种子提取液对油菜种子萌发及幼根生长的影响（略）
表2 激素法处理南方红豆杉种子提取液对油菜种子萌发及幼根生长的影响（略）
表3 变温层积法处理南方红豆杉种子提取液对油菜种子萌发及幼根生长的影响（略）
表4 激素加变温层积法处理南方红豆杉种子提取液对油菜种子萌发及幼根生长的影响（略）
表5 未破除休眠南方红豆杉种子提取液对油菜种子萌发及幼根生长的影响（略）
4 分析与讨论
根据四种方法处理过的及未处理过的南方红豆杉种子水提液对油菜种子发芽抑制情况，将上述所示的抑制率与48h后的平均根长两个指标作曲线图。
图1 示四种方法处理后种子提取液对油菜种子的发芽抑制率（略）
图2 示四种方法处理后油菜种子48h后主根平均根长（略）
由图1可见，激素加变温层积法处理后，发芽抑制率降低了18%。而且油菜种子的发芽抑制率随着提取液浓度的增大而提高的，当浓度为0.5g/ml时，抑制率大小排列为未经处理＞激素法＞变温层积法＞流水法＞激素加变温层积法。由图2可见，四种方法处理后，种子提取液对油菜种子48h后的平均根长随着浓度的增大而减短，当浓度为0.5g/ml时，平均根长生长情况排列为未经处理＜变温层积法＜流水法＜激素法＜激素加变温层积法，激素加变温层积法处理后，平均根长增加了0.49cm。说明四种方法对种子内发芽抑制物质均有一定的降解作用。
发芽抑制物质的存在是南方红豆杉种子休眠的主要原因之一，利用激素加变温层积法，可解除发芽抑制物质，也可促进种胚的发育，是一种比较的破除休眠方法
【】
1］ 张钢民,张涛,杨文利.红豆杉属植物的研究进展［J］.河北农业大学学报,1998,21(4):104?107.
［2］ 《种子工作手册》编写组.种子工作手册［M］.上海:上海科学技术出版社，1976:7?8.
［3］ 陈雪英,梁敬钰.人工栽培的南方红豆杉化学成分(Ⅰ)［J］.天然药物,2006,4(1):52?57.
［4］ Kohler D R,Goldspiel B R.Paclitaxel taxol［J］.Phamacotherapy,1994,1(41):3?34.
［5］ 高兆蔚.福建省南方红豆杉的分布、生境和栽培技术研究［J］.华东森林经理，2003,17(2):6?13.
［6］ 陈登雄,方兴添,郭祥泉，等.南方红豆杉种子催芽研究初探［J］.福建林学院学报,1998,18(3):267?269.
