海水中致病性弧菌分离及抗菌药物敏感性分析

                  作者：韩善桥 虞积耀 姜涛 王大鹏 

【摘要】  目的 了解我国东南沿海海水中致病性弧菌的分布情况及其对抗菌药物的敏感性。 方法 用海水采样器采集海水，经增菌培养和细菌分离，进行细菌鉴定和抗菌药物敏感性试验。 结果 从160份海水中分离出弧菌科细菌339株，其中弧菌属295株（87.0%）,气单胞菌属42株(12.4%),邻单胞菌属2株（0.6%）。药敏试验结果显示，150株致病性弧菌对亚胺培南及头孢哌酮/舒巴坦的药物敏感率为100%，对头孢哌酮、复方磺胺甲噁唑、庆大霉素、奈替米星、头孢噻肟、头孢他啶和左氧氟沙星的药物敏感率在90.0%～98.7%，对头孢唑啉和氨苄西林的敏感率较差，仅为28.0%和30.0%。 结论 海水中致病性弧菌分离及抗菌药物敏感性分析，对海洋弧菌所致疾病的预防、诊断和都具有重要指导意义。

【关键词】  海水； 弧菌； 抗菌药物； 药敏试验

    ABSTRACT  Objective  To  investigate  the  distribution of pathogenic vibrio and antimicrobial susceptibility in brine of Southeast China Sea area. Methods  Pathogenic vibrio from different regions of straits were cultured, separated and identified.Microbial sensitivity tests were performed with the Kirby-Bauer method. Results  Among 339   bacteria strains isolated from brine, 295 strains (87.1%) were Vibrio, 42 strains (12.3%) were Aeromonas, 2 strains (0.6%) were  Plesiomonas. The susceptibilities of the bacteria to 18 kinds of antibiotics were tested,the susceptibility rates to  imipenem and cefoperazone/sulbactam were 100%,to cefoperazone，trimethoprim/sulfamethoxazole, gentamicin, netilmicin, cefotaxime, ceftazidime and levofloxacin were 90.0%～98.7%,to cefazolin and ampicillin were 28.0% and 30.0%. Conclusion  This investigation will be of great significance for prevention and therapy of  bacteria infection in brine.

    KEY WORDS  Brine; Vibrio; Antimicrobial agent;  Antimicrobial susceptibility  test

    弧菌广泛分布于海水和海产品中，人们常常因接触海水或食入被弧菌污染的食物而引起感染。为了解我国东南沿海海水中致病性弧菌的分布情况及弧菌对抗菌药物的敏感性，以提供预防致病性弧菌感染的流行病学依据。2001年4月～2006年5月，我们对东南沿海码头、港口、海边及近海海水采样进行致病性弧菌的分离与鉴定，并对150株致病性弧菌做了抗菌药物敏感性试验，现将结果报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  海水采集

    1.1.1  海水采集地点 （1）港口、码头和海边：从福州到厦门采集40个点海水。（2）近海：距福建沿海岸边约5Km，从福建三都岛到东山岛采集40个点的海水。

    1.1.2  海水采集方法  用无菌海水采样器采集海水（采样器由国家海洋局天津海洋技术研究所生产），取水面下30cm～100cm深处的海水，每个点取2份，每份500ml，共160份海水。

    1.2  培养基和试剂

    1.2.1  增菌培养基  碱性蛋白胨水、嗜盐菌增菌液和营养肉汤（英国Oxoid公司产品）。

    1.2.2  分离培养基  TCBS琼脂、血琼脂和麦康凯琼脂（英国Oxoid公司产品）。

    1.2.3  生化反应试剂  英国Oxoid公司产品。

    1.2.4  诊断血清  霍乱弧菌O1群及O139群诊断血清（疾病预防控制中心传染病预防控制所产品）。

    1.2.5  Muller–Hinton(MH)琼脂  法国生物梅里埃公司产品。

    1.2.6  药敏纸片  英国Oxoid公司产品。

    1.3  VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪  法国生物梅里埃公司产品。

    1.4  方法

    1.4.1  细菌分离  （1）无菌手续取海水25ml，加入225ml碱性蛋白胨水增菌液中，35℃增菌培养6～8h，取表面培养物分别接种TCBS琼脂、血琼脂和麦康凯琼脂，35℃培养18～24h，观察菌落特征，挑取可疑菌落进行细菌分纯。（2）无菌手续取海水25ml，加入225ml嗜盐菌增菌液中，35℃增菌培养8～16h，取培养物分别接种TCBS琼脂和血琼脂，35℃培养18～24h，观察菌落特征，挑取可疑菌落进行细菌分纯。（3）无菌手续取海水25ml，加入225ml营养肉汤中，35℃增菌培养16～18h，取培养物分别接种TCBS琼脂、血琼脂和麦康凯琼脂，35℃培养18～24h，观察菌落特征，挑取可疑菌落进行细菌分纯。

    1.4.2  细菌鉴定  取分纯平板细菌涂片革兰染色，做氧化酶、氧化发酵和O/129敏感性试验，确定为弧菌科细菌后进行手工及全自动微生物分析仪鉴定，按[1，2]进行细菌属、种和型的鉴定。注意麦氏弧菌氧化酶试验为阴性，与肠杆菌科细菌鉴别可用硝酸盐还原试验。对生化反应疑似霍乱弧菌的细菌分别做O1 和O139群血清凝集试验。

    1.4.3  药敏实验  采用琼脂扩散（K-B）法：取分纯平板细菌制成菌悬液，涂布于MH琼脂上，放置药敏纸片，35℃培养18～24h，测定抑菌圈大小，按临床和实验室标准协会（CLSI）标准判断药敏结果。

    2   结果

    2.1  致病性弧菌的检出情况

    160份海水分离出弧菌科细菌3属16种339株，见表1。表1  弧菌科细菌种类检出结果

    2.2  致病性弧菌对抗菌药物的敏感性结果

    150株致病性弧菌，其中溶藻弧菌44株、副溶血弧菌32株、沙鱼弧菌20株、麦氏弧菌12株、海鱼弧菌10株、河弧菌8株、非O1非O139群霍乱弧菌8株、霍利斯弧菌6株、辛辛那提弧菌4株、创伤弧菌4株及弗尼斯弧菌2株，对18种抗菌药物的敏感性结果，见表2。表2     致病性弧菌对抗菌药物敏感性结果

    3 讨论

    本次调查近海岸的海水取自福建省福州、宁德、莆田、泉州、厦门和漳州的港口、码头和海边，海水采集时避开有水产养殖的地方。近海海水取自从福建三都岛到东山岛距海岸约5Km。海水采样时间长、范围大，较为客观地反映了我国东南沿海海域表层海水中弧菌的种类及分布情况。

    海水弧菌的分离与采样技术、培养基选择、培养条件（时间、温度）及鉴定技术等有关。通过改变培养基中氯化钠的含量，可提高海水弧菌的检出率及检出种类，含0.5%NaCl碱性蛋白胨水（加入1%亚碲酸钾和青霉素）有利于霍乱弧菌的生长[3]，含1.0%NaCl碱性蛋白胨水（加入640mg/L血红蛋白）有利于分离创伤弧菌[4]，2.5%NaCl碱性蛋白胨水有利于麦氏弧菌的检出[5]， 4.0%NaCl嗜盐菌增菌液有利于副溶血弧菌和嗜盐弧菌的分离[3]。在配制培养基时用海水代替蒸馏水，也可提高海水弧菌的检出率。值得注意的是，由于海洋弧菌形态常因不同培养条件而产生多变性，有些生化反应不够稳定，菌种在保存和移种过程中容易发生变异和死亡，尚缺少公认的海洋弧菌鉴定检索表和药敏结果判断标准，因此，给海洋弧菌研究工作带来一定的困难。

    调查结果显示， 160份海水标本弧菌检出率为100%，分离出弧菌科细菌339株，其中弧菌属295株（87.0%），气单胞菌属42株（12.4%），邻单胞菌属2株（0.6%））。海水弧菌种类检出结果，海水中弧菌主要是溶藻弧菌88株（25.9%），其次是副溶血弧菌65株（19.2%），第三是沙鱼弧菌38株（11.2%）。不同采样点分离到的弧菌数量及种类不同，近海海水以溶藻弧菌、副溶血弧菌、沙鱼弧菌、和麦氏弧菌为主。

    致病性弧菌对18种抗菌药物敏感性试验表明，致病性弧菌对头孢唑啉和氨苄西林的敏感率低，仅为28.0%和30.0%，对二代头孢菌素也产生了一定的耐药性，对同类抗菌药物的敏感性也存在一定差异。受检弧菌对头孢他啶、头孢噻肟、亚胺培南、庆大霉素、奈替米星、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑和头孢哌酮/舒巴坦的敏感率高，提示我们在由于海洋弧菌所致的感染时，应选择抗菌活性好，药敏试验敏感率高的抗菌药物。

    致病性弧菌广泛分布于海水及海洋生物中，可以引起人类肠道感染、伤口感染和败血症等[6-8]。由创伤弧菌所致的脓毒血症以及由O139群霍乱弧菌引起的新型霍乱在国内也时有报道[9-10]。致病性弧菌已成为我国沿海地区散发性、流行性腹泻和食物中毒的重要病原菌，对驻岛人员、海上训练及作业人员具有潜在的致病危险，因此，开展海洋弧菌的研究，对致病性弧菌所致疾病的防治具有重要意义。

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