地红霉素肠溶颗粒在健康人体的生物利用度及药动学

                   作者：张志华，周彦彬，丁劲松，田娟 

【摘要】  目的：建立正常人血浆中红霉胺HPLC-MS测定法，研究地红霉素两种肠溶制剂的人体生物利用度和药动学。方法：以克拉霉素为内标，血浆样品碱化后用乙酸乙酯萃取，经Thermo Hypersil-Hypurity C18柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）分离，以MS检测器检测。采用二周期随机交叉试验设计，将18名健康男性志愿者随机等分成两组，分别单剂量口服0.5 g地红霉素肠溶颗粒剂（试验制剂 T）或地红霉素肠溶片（参比制剂 R）。结果：红霉胺与内标分离度好，内源性杂质不干扰测定。红霉胺浓度在3.1～736 μg/L 范围内与峰面积比线性关系良好，最小可定量浓度为3.1 μg/L。回收率为97.0%～99.1%（n=5），日内RSD为4.0%～9.9%（n=5）；日间RSD为4.4%～11.2%（n=15）。 T与R的Tmax分别为（2.6±0.7）h、（2.6±0.8）h；Cmax分别为（339.4±118.1）μg/L和（360.8±139.5）μg/L；AUC0→144分别为（3 225.0±986.5）μg·h/L和（3 188.2±1057.9）μg·h/L；T1/2 分别为（44.7±3.5）h和（42.6±5.9）h。与参比制剂相比，试验制剂的相对生物利用度为（103.1±17.5）%。药动学参数经多因数方差分析显示周期间与制剂间差异均无统计学意义（P>0.05），双单侧t检验表明接受T与R生物等效的假设，经90%置信区间均在规定值内。结论：T与R为生物等效制剂。

【关键词】  地红霉素；红霉胺；高效液相色谱-质谱法；相对生物利用度

    ［Abstract］Objective: To establish an HPLC-MS method for determination of erythromycylamine in human plasma and to study the pharmacokinetics and the relative bioavailability of two enteric dirithromycin preparations.Methods:With clarithromycin as its internal standard, the sample of blood plasm,after alkalized,were extracted by acetic ether,then separated on a Thermo Hypersil-Hypurity column (C18 150 mm×2.1 mm,5 μm),and detected by a MS detector.In a test of two periods of a random crossover study,an oral dose of 0.5 g dirithromycin enteric-granule (T) and its reference (R) were administrated to two groups of healthy volunteers with 9 in each. and then the pharmacokinetics and relative bioavailability were studied.Results: The calibration curve was linear within the range 3.1 to 736 μg/L, the recovery rate of erythromycylamine from plasma was in the range of 97.0%～99.1% (n=5), inter-day and intra-day RSD were 4.0%～9.9% (n=5) and 4.4%～11.2% (n=15) respectively.The main pharmacokinetics of T and R were as following:AUC0→144were (3,225.0±986.5) μg·h/L and (3,188.2±1,057.9)μg·h/L;Tmax were (2.6±0.7)h and (2.6±0.8)h;Cmax were (339.4±118.1)μg/L and (360.8±139.5)μg/L;T1/2were (44.7±3.5)h and (42.6   5.9)h.The result of ANOVA and two one-side t-test statistical analysis showed no significant differences among T and R (P>0.05).The 90% confidence interval was in the regulated range.Conclusions:T and R are bioequivalent.

    ［Key words］Dirithromycin;Erythromycylamine;HPLC-MS;Relative bioavailability

    地红霉素（Dirithromycin）为大环内酯类抗生素，是红霉胺的前体药物，口服给药后很快转变成红霉胺而起作用，其抗菌谱和抗菌活性与红霉素相似。地红霉素在软组织中的药学特性较红霉素有所改善，消除半衰期长，且与其他由细胞色素P450系统代谢的药物相互作用少［1］。因此，常以测定红霉胺的血药浓度来研究地红霉素体内的药动学特征。本实验建立了HPLC-MS法测定红霉胺的血药浓度，采用二周期随机交叉试验设计，比较了地红霉素肠溶颗粒与肠溶片在18名健康受试者体内的药动学及相对生物利用度，旨在评价试验制剂与参比制剂的生物等效性，为临床合理用药提供依据。

    1  材料与方法

    1.1  仪器

    LC-MS2010液相色谱-质谱联用仪，LC-10AD VP低压四元梯度泵，CTO-10A VP柱温箱，SCL-10AD VP系统控制器，LC-MS solution工作站（日本岛津）；DZF-6020型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；TG16-W微量高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；ER-182A型天平（日本AND公司）。

    1.2  试药

    地红霉素肠溶颗粒（0.25 g/包，海南皇隆制药厂有限公司，批号：050701）；地红霉素肠溶片（商品名：域大，0.25 g/片，湖南维康制药有限公司，批号：20031201）；红霉胺标准品（药品生物制品检定所）；克拉霉素标准品（内标，中国药品生物制品检定所，997 IU/mg），乙腈（色谱纯，Caledon Company）；乙酸乙酯（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；甲醇（色谱纯，浙江临海市浙东特种试剂厂）；其它试剂均为国产分析纯（AR级）；所有试验用水均为重蒸馏水。

    1.3  受试者及试验设计

    受试者均为健康男性，年龄21～25岁，体重52～72 kg，无烟酒嗜好，试验前经询问病史、体格检查和实验室检查未发现异常。无药物过敏史和药物依赖史，无慢性病史，四周内未服用任何可能影响本品吸收、代谢的药物。受试期间统一清淡饮食，不使用除试验（参比）制剂以外的任何药物，不接受烟、酒及含咖啡的饮料，试验前签署知情同意书。

    采用二周期随机交叉自身对照试验，将18名受试者等分成二组。分别在二周期内口服地红霉素受试制剂和参比制剂0.5 g，服药前及服药后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0、120.0、144.0 h分别取血5 mL。洗脱期为14 d，交叉给药后取血方法和时间相同。取血后离心分取血浆，-20 ℃保存。血浆样品用新建立的HPLC-MS方法测定。

    1.4  血样测定

    1.4.1  标准溶液配制  红霉胺溶液：精确称取红霉胺18.4 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度（184 μg/mL）。置于4 ℃冰箱中保存，使用时用流动相稀释至所需浓度。内标溶液：称取克拉霉素12.5 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，应用时进一步稀释为12.5 μg/mL，置于4 ℃冰箱中保存备用。

    1.4.2  色谱条件及质谱条件  色谱柱：Thermo Hypersil-Hypurity C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；柱温：45 ℃；流动相：10 mmol/L醋酸铵（pH 6.4）-甲醇-乙腈=50 ∶10 ∶30；流速：0.2 mL/min。质谱条件：电喷雾电离源（ESI），选择性正离子监测（SIM），监测质荷比（M/Z）368（红霉胺，M+2H）和237（克拉霉素，M+H）带正电荷的分子离子峰，电离源电压4.5 kV，喷雾气氮气（N2），流速1.5 L/min，脱溶剂温度250 ℃，检测器电压1.5 kV。

    1.4.3  血浆样品预处理  取待测血浆0.2 mL于2 mL离心管中，加入内标溶液（12.5 μg/L）50 μL， 加饱和碳酸钠溶液0.1 mL，混匀，加乙酸乙酯1 mL，振荡2 min，14 000 r/min离心5 min，将有机相转移至另一管中，45 ℃真空干燥箱中抽干，残渣用流动相100 μL溶解，取上清液5 μL进样。

    1.5  参数的计算与数据处理

    从药时曲线获得两种制剂的主要药动学参数，Cmax及Tmax采用实测值，AUC0→144以梯形面积法计算，以消除后相血药浓度对数值和时间回归计算消除速率常数K和半衰期T1/2。AUC0→∞=AUC0→t+Ct/K，以试验制剂AUC0→t和参比制剂AUC0→t的比值计算生物利用度（F）、AUC0→t和Cmax，经对数转换后进行药物间、周期间、个体间的三因素方差分析，再以双单侧t检验进行等效性判断。若受试制剂AUC0→t的90%可信限落在参比制剂80%～125%范围内，Cmax的90%可信限落在70%～143%范围内，则认定受试制剂与参比制剂生物等效。Tmax采用原值进行非参数检验。

    2  结果

    2.1  色谱行为

    红霉胺的保留时间约为5.4 min，内标的保留时间约为 3.2 min，基线平稳，血浆内源性物质及其它杂质不干扰样品的分离测定。红霉胺和克拉霉素标准液、空白血样、空白血样中加入标准品及受试者服药后3 h血浆的总离子流图见图1。

    2.2  线性关系

    用空白血浆将红霉胺标准贮备液稀释成浓度分别为 3.1、9.2、18.4、36.8、73.6、147.2、368.0、736.0 μg/L的系列浓度溶液，漩涡振荡2 min，混匀，余照“血浆样品预处理”项下操作，记录红霉胺及内标的峰面积。以红霉胺和内标峰面积比（A/AIS）与红霉胺浓度（C）进行线性回归，得回归方程为：A/AIS＝0.0139C-0.0052，r2=0.9981，红霉胺浓度在3.1～736.0 μg/L 范围内与峰面积比线性关系良好，最小可定量浓度为3.1 μg/L。

    2.3  回收率及精密度

    配制含红霉胺浓度分别为3.1、73.6、736.0 μg/L的血浆样品各5份，按“血浆样品预处理”项下操作，记录红霉胺和内标峰面积，按回归方程测得浓度，以测得值与加入值的比值计算回收率，并计算日内精密度，高、中、低浓度回收率为（99.1±4.0）%、（97.0±3.7）%、（98.7±9.9）%（n=5），日内RSD为4.0%～10.0%（n=5）。对上述样品连续测定3 d，考察日间精密度，日间精密度为4.4%～11.2%（n=15）。

    2.4  血样测定和药物动力学参数

    18例健康志愿者单剂量口服地红霉素试验制剂或参比制剂0.5 g后，红霉胺的主要药动学参数见表1，平均血药浓度时间曲线见图2。表1  健康受试者口服0.5 g地红霉素后主要
 药动学参数（略）血浆红霉胺平均浓度-时间曲线(0～24 h)

    2.5  统计检验结果

    对地红霉素试验制剂与参比制剂的Cmax及AUC0→144经对数转换后进行方差分析，结果表明主要药物动力学参数没有显著差异（P>0.05），双单侧t检验及90%可信限检验表明试验制剂Cmax及AUC0→144的均值落在规定范围内，结果见表2。Tmax原值经非参数检验，两种制剂间差异无统计学意义。表2  健康受试者口服0.5 g地红霉素后Cmax及AUC0→144双单侧t检验结果和90％置信区间（略）

    3  讨论

    有关红霉胺血药浓度测定的方法国内外报道的通常采用微生物法［2-3］和HPLC-UV法［4］，也有采用HPLC-MS［5-6］法和HPLC-ECD［7-8］法的报道。与其他大环内酯类药物一样，红霉胺仅在短波长范围内有很弱的紫外吸收，用紫外法测定生物样品时灵敏度低。而

    微生物法测定的是样品对敏感菌株的抑菌活性，可能受到血浆蛋白结合、活性代谢物等因素的影响，选择性差。采用ED可实现灵敏检测，但对流动相或样品进行加电压增敏处理时同时增加了基线噪音和干扰峰，影响测定结果。高效液相色谱-质谱联用技术具有色谱分离和质谱分离的双重功能，可以依靠质谱的分辨能力区分不同物质的色谱峰，抗干扰能力强［5-6］。本文新建立的HPLC-MS法，取样量小，样品处理快速简便，方法选择性好，干扰少，回收率高，最小可定量浓度为3.1 μg/L，完全能够满足本试验低浓度药物测定以及药物动力学研究的要求。

    试验证实地红霉素肠溶颗粒与肠溶片在健康受试者体内的药动学特征，各药动学参数之间比较差异无统计学意义，说明试验制剂与参比制剂生物等效。

【文献】
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