奈替米星的光度分析研究

【摘要】  奈替米星(NTM)与曲利本蓝(TB)在pH2.5～6.0的条件下反应生成具有正吸收和负吸收的蓝色离子缔合物，其最大吸收波长位于688nm，线性范围为0～8.6mg/L；最大褪色波长为592nm，线性范围为0～9.5mg/L；表观摩尔吸光系数(ε)为1.08×104(正吸收)L/(mol·cm)和3.26×104(负吸收)L/(mol·cm)。当用双波长叠加法时，ε值可达4.35×104L/(mol·cm)。本文探讨了适宜的反应条件及主要分析化学性质。该法操作简便，有较高的灵敏度和选择性，用于市售奈替米星药物中奈替米星含量的测定，结果满意。

【关键词】  奈替米星； 曲利本蓝； 分光光度法

    ABSTRACT  In the condition of pH 2.5～6.0, netilmicin (NTM) reacts with trypan blue (TB) to form blue ion association complexes with an obvious absorption peak and an fading peak. The maximum absorption wavelengths were located at 688nm, the linear range was 0～8.6mg/L; The maximum fading wavelengths were located at 592nm, the linear range was 0～9.5mg/L; Their apparent molar absorptivities (ε) part was 1.08×104 (positive absorption) and 3.26×104 (negative absorption ) L/(mol·cm). When the dual?wavelength overlapping absorption spectrometry was used to determine the netilmicin, its apparent molar absorptivities (ε) achieved 4.35×104 L/(mol·cm). The optimum reaction conditions and the chief properties of analytical chemistry were studied. The method was simple and convenient, moreover possess higher sensitivity and selectivity, it could be applied to determine the content of the netilmicin with satisfactory results.

    KEY WORDS  Netilmicin;  Trypan blue;  Spectrophotometry

    奈替米星(netilmicin)是美国Schering?Plough公司开发的一种氨基糖苷类抗生素，其抗菌谱广，活性强，耳、肾毒性较其它同类药物小，已广泛用于临床。目前已报道的检测奈替米星的方法主要有微生物法［1，2］、HPLC法［3～8］、HPLC?间接光度法［9，10］、薄层色谱法［11，12］、旋光法［13，14］和毛细管电泳法［15］等，分光光度法基本未见报道。本文利用紫外?可见分光光度法对奈替米星进行了分析研究，发现奈替米星(NTM)与曲利本蓝(trypan blue，TB)在酸性条件下反应后生成具有正吸收和负吸收的蓝色离子缔合物，其最大正吸收波长位于688nm，线性范围为0～8.6mg/L，表观摩尔吸光系数(ε)为1.08×104L/(mol·cm)；最大褪色波长位于592nm，线性范围从0～9.5mg/L，表观摩尔吸光系数(ε)为3.26×104L/(mol·cm)。若用双波长叠加法测定，其ε值可提高到4.35×104L/(mol·cm)。奈替米星在一定浓度范围内遵从朗伯比耳定律，由此建立了测定奈替米星的曲利本蓝分光光度法。该法具有较高的灵敏度和良好的选择性，pH范围宽，稳定性好，操作简便快速，用于市售奈替米星药物中奈替米星含量的测定，结果满意。

    1  实验部分

    1.1  仪器与试剂

    U?4100型紫外?可见?近红外光谱仪(日立公司，日本)；7230G型分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；HI9024便携式防水型酸碱度测试仪(意大利哈纳仪器/北京哈纳科仪科技有限公司)。

    奈替米星(药品生物制品检定所，批号0355?200001)标准溶液：储备液浓度1.0×10-3mol/L，操作液浓度1.0×10-4mol/L；曲利本蓝(中国医药集团上海化学试剂公司)溶液：储备液浓度1.0×10-3mol/L，操作液浓度1.0×10-4mol/L；HAc?NaAc缓冲溶液：0.2mol/L NaAc溶液与0.2mol/L HAc溶液按一定比例混合，配成一系列不同pH值的缓冲溶液；BR缓冲溶液：0.01mol/L H3PO4、H3BO3和HAc与0.2mol/L NaOH溶液按一定比例混合，配成一系列不同pH值的缓冲溶液；表面活性剂：乳化剂OP 1%；溴化十六烷基三甲基铵(CTMAB)0.5g/L；十二烷基硫酸钠(SDS)l0g/L；十二烷基磺酸钠(SLS)0.5g/L；Triton X?100 8g/L。奈替米星标准品为生化试剂，其余试剂均为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。

    1.2  试验方法

    在10ml比色管中，依次准确加入4.00ml 1.0×10-4mol/L的曲利本蓝溶液，一定量的1.0×10-4mol/L的奈替米星标准溶液，1.0ml pH2.85的HAc?NaAc缓冲溶液，用水稀释至刻度，摇匀，20min后用1cm比色皿，以试剂空白为参比，在最大吸收波长或最大褪色波长处测其吸光度。

    2  结果与讨论

    2.1  吸收光谱

    按试验方法配制溶液，在U?4100型紫外?可见?近红外光谱仪上扫描吸收光谱(Fig.1)。试验表明，奈替米星在可见光范围内无吸收；曲利本蓝在可见光区产生强烈吸收，最大吸收波长为588nm；在曲利本蓝溶液中加入奈替米星标准溶液后，TB和NTM反应，由于静电作用形成具有正吸收和负吸收的蓝色离子缔合物，最大显色波长为688nm，红移100nm，最大褪色波长位于592nm，红移4nm；若以负吸收波长作为参比波长，正吸收波长作为测定波长，灵敏度会更高。奈替米星在一定浓度范围内呈线性关系(Fig.1)。可见，显色法、褪色法及双波长叠加法均可用于奈替米星含量的测定。

    2.2  反应条件的选择

    (1)缓冲体系及pH值的影响  考察了HAc?NaAc缓冲溶液和BR缓冲溶液对NTM?TB离子缔合物的影响。结果表明，使用HAc?NaAc缓冲体系效果较好，它不仅灵敏度高，而且适宜的pH范围较宽(pH2.5～6.0)，缔合物稳定。试验用pH2.85的HAc?NaAc缓冲溶液，用量以1.0ml为宜。

    (2)显色剂用量的影响  考察了1.0×10-4mol/L TB溶液用量为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0ml时对体系吸光度的影响(Fig.2)，结果表明，TB溶液用量在3.5～4.5ml范围吸光度较大，试验用4.0ml TB溶液。

    (3)显色时间和缔合物的稳定性  按试验方法配制溶液后，在不同时间下测定NTM?TB缔合物的吸光度， 结果表明， 在室温下5min后显色稳定， 稳定时

    I:  1: NTM, against water;  2: TB, against water; 3: NTM+TB, against water;

    II:  1: NTM (0.5ml)+TB;  2: NTM (1.0ml)+TB;  3: NTM (1.5ml)+TB;  1～3: Against reagent blank

    Fig.1    The absorption spectra of ion?association complexes of trypan blue?netilmicinFig.2    Effect of trypan blue volumn

    间至少在6h以上。实验选在10min后进行。

    (4)表面活性剂的影响  考察了多种表面活性剂对缔合反应的影响，结果表明，非离子型表面活性剂Triton X?100、乳化剂OP及阳离子表面活性剂CTMAB、阴离子表面活性剂SLS和SDS等对NTM?TB缔合物均无增敏作用。

    2.3  离子缔合物的组成

    考察了摩尔比法和等摩尔连续变化法测定NTM?TB离子缔合物的组成，结果均为NTM∶TB=1∶4，故缔合物的组成为NTM(TB)4。

    2.4  标准曲线

    分别将4.00ml 1.0×10-4mol/L的TB溶液加入数支10ml比色管中，再依次加入不同量的1.0×10-4mol/L的NTM标准溶液及1.0ml pH2.85的HAc?NaAc缓冲溶液，用水稀释至刻度，摇匀，放置10min后按试验方法测其吸光度，作A?C标准曲线。该方法的标准曲线回归方程、相关系数、线性范围及表观摩尔吸光系数等列于Tab.1。

    2.5  共存离子的影响

    奈替米星含量为4.76μg/ml，相对误差≤±5%时，以下共存离子不干扰测定：Na+、K+、Ac-、D?苏氨酸、D?色氨酸(1000倍)；DL?天冬氨酸、L?异白氨酸、甘氨酸、乳糖、蔗糖、麦芽糖(300倍)；L?组氨酸、L?胱氨酸(200倍)；葡萄糖、D?果糖(150倍)；淀粉、甘氨酸(50倍)；Mg2+、Sb(III)(30倍)；H2PO4-(20倍)；PO43-、羟甲基纤维素钠(15倍)；Cu2+、Ba2+、Sr2+(10倍)；Fe3+、NH4+、SiO32-(5倍)；Pb2+、Zn2+、Bi3+、Ca2+、F-、CO32-(4倍)；Mn2+、Br-、Be2+、S2O32-、I-(2倍)；C2O42-(0.5倍)；Al3+、Cd2+、Cr3+(0.2倍)。可见除少数几种金属离子和C2O42-干扰较大外，其余离子及常见氨基酸、糖类均不干扰测定，故本方法具有良好的选择性。

    3  分析应用

    取硫酸奈替米星注射液(济南利民制药有限公司；江苏济川制药有限公司)各1支，分别置100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。移取硫酸奈替米星溶液4.0ml置于100ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。取硫酸奈替米星溶液各1.0ml进行分析，结果见Tab.2和Tab.3。

【】
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