3，5-二硝基水杨酸法测定安络小皮伞菌中多糖的含量
作者：崔本连，宋海韬，齐放，王淑敏
【摘要】 目的:建立小皮伞菌中多糖含量测定方法。方法:采用3，5-二硝基水杨酸法（简称DNS法）对安络小皮伞菌多糖进行含量测定。结果:经DNS试剂显色后于500nm处测定吸光度，在此波长处溶液的吸光度与葡萄糖含量呈良好的线性关系，线性范围:0.03～0.12mg.ml，回归方程A=5.411C-0.0654，r=0.9998。平均回收率为103.76%，RSD=0.60%。结论:该方法简单易行，重复性好，能较好地控制产品质量。
【关键词】 安络小皮伞菌;3，5-二硝基水杨酸法;多糖;方药研究
安络小皮伞（Marasmius androsocus Tr.）为我国民间传统的药用真菌，具有止痛消炎等功能，对三叉神经痛、坐骨神经痛、面神经麻痹、偏头痛和风湿性关节炎等疗效较好。为更好的控制其质量，拟对其主要成分多糖含量的测定方法进行研究。
1 实验材料
仪器与试剂:Cary50紫外分光光度计（美国瓦里安）;葡萄糖、酒石酸甲钠、氢氧化钠、无水亚硫酸钠、苯酚、3，5-二硝基水杨酸均为分析纯;3，5-二硝基水杨酸试剂（DNS）的配制:取酒石酸钾钠182g，加热水至500ml使溶解，加3，5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21g，重蒸苯酚5g和无水亚硫酸钠5g，搅拌使溶解，冷却后加水稀释至1000ml，储于棕色瓶中，备用。
2 方法与结果
2.1 实验方法［1-4］
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品50.00mg，置50ml容量瓶中，加水适量使溶解并用水稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含1.00mg葡萄糖的对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备 单糖供试品溶液的制备:准确称取样品0.1500g，置于50ml锥形瓶中，加水40ml使溶解，离心，上清液转移至50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，从中精密吸取3ml于50ml量瓶，滴加10%氢氧化钠溶液调至pH至9，精密加3，5-二硝基水杨酸试液2ml，混匀，置于浴中加热15min，流水冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
总糖供试品溶液的制备:准确称取等量样品，置于50ml锥形瓶中，加水40ml使溶解，离心，上清液转移至50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，从中精密吸取3ml于50ml量瓶，加5%HCl溶液3ml，沸水溶水解30min，流水冷却至室温，滴加105氢氧化钠溶液调节pH至9，精密加3，5-二硝基水杨酸试液2ml，混匀，置水浴中加热15min，流水冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
2.1.3 测定方法 分别取单糖和总糖供试品溶液，照分光光度法［1］ ，以空白为参比，在550μm的波长处分别测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中单糖浓度和总糖浓度，，即得。用总糖量减去单糖量即为安络小皮伞菌多糖量。
2.2 方法学考察
2.2.1 测定波长的选择 精密量取对照品溶液、蒸馏水各1.5ml分别置于50ml量瓶中，分别加3，5-二硝基水杨酸试液2.0ml，于沸水浴中加热15min，流水冷却至室温，加水稀释至刻度。以显色剂-水，葡萄糖液-水，葡萄糖液-显色剂分别在波长300～800nm范围内分别进行扫描，结果最大吸收波长是370nm，但在550nm前显色剂的干扰严重，故测量波长应选550nm更合理。
2.2.2 反应时间考察 精密量取对照品溶液、蒸馏水各5ml分别置于50ml量瓶中，分别加3，5-二硝基水杨酸试液2.0ml（共10份），于沸水浴中分别加热1、2、3、5、8、10、15、20、25、35min，流水冷却至室温，加水稀释至刻度。以空白为参比，在波长550nm处测其不同水浴时间的吸光度，结果见表1。
表1 不同反应时间吸收度值（略）
由表1可以看出，随着时间的延长，吸光度逐渐变大，但在3～10min内和15～35min内都有一个相对的稳定区域，综合考虑认为选择15min更能反映样品的真实含量。
2.2.3 样品水解时间 方法同总糖供试品溶液制备，选择不同水解时间对样品进行测定，结果见表2。
表2 不同水解时间吸收度值（略）
表明:水解时间以30min为最佳。
2.2.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液1.5、2.5、3.5、5.0、6.0ml分别置于50ml量瓶中，分别补加水6.5、5.5、4.5、3.0、2.0ml，另取水8ml于50ml量瓶作空白对照。上述溶液分别加3，5-二硝基水杨酸试液2.0ml，于沸水浴中加热15min，流水冷却至室温，加水稀释至刻度。按分光光度法［1］ ，以空白为参比，于550nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程A=5.4111C-0.0654，r=0.9998，由此确定葡萄糖线性范围为0.03～0.12mg.ml。
2.2.5 精密度试验 取同一处理样品溶液，连续测定5次吸光度值，A值分别为0.4292、0.4292、0.4288、064284、0.4290。RSD为0.06%，表明仪器、方法的精密度良好。
2.2.6 稳定性试验 取同一处理样品溶液，室温放置0、30、60、90、120min，依法测定吸光度值。A值分别为0.4255、0.4262、0.4258、0.4264、0.4270，供试品溶液在2h内测定结果的RSD分别为0.14%，表明供试品中多糖的含量稳定性良好。
2.2.7 重复性实验 精密称取同一批样品共5份，按供试品溶液项下制备，依法独立测定，样品含量，以考察本法的重现性，以多糖为含量测定指标考察方法重现性，结果ROD为0.60%。表明该方法重现性良好。
2.2.8 样品加样回收试验 取同一批样品（148.6667mg.g），按供试品溶液制备方法处理的水解液共5份，各取1.5ml分别置于50ml容量瓶，分别加标准品溶液2.3ml，再分别加3，5-二硝基水杨酸试液2ml，于沸水浴中加热15min，流水冷却，加水稀释至刻度，按分光光度法于550nm处测A值。结果表明，RSD为0.60%，表明本法准确性较好，方法可行。
2.3 3批样品含量测定 取3批安络小皮伞菌药材，依法测定药材中多糖含量 通过对3批小皮伞菌的含量测定表明，多糖含量以葡萄糖计（C 6 H 12 O 6 ）均值为18.63%。
3 小结与讨论
安络小皮伞菌原标准简单，没有含量检测项，因此达不到有效控制质量的目的。研究发现，菌类多糖具有较强的生物活性，因此以多糖为含量测定指标具有一定的实际意义。新建立的多糖含量测定方法经过方法考察，证明本法具有一定的专属性、准确性、重现性和实用性，可有效地控制产品的内在质量变化。
【】
［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:化学出版社，2005.
［2］陈齐英，孙雪奇，徐晓霞.3，5-二硝基水杨酸比色法测定亮菌口服液中多糖的含量［J］.华西药学杂志，2000，15（3）:193-194.
［3］尹银嘉，魏士超，马宝瑕.3，5-二硝基水杨酸法测定二味康口服液中多糖的含量［J］.药学杂志，2003，23（7）:414-416.
［4］张 英，王淑敏.盐制杜仲的炮制工艺研究［J］.长春中医药大学学报，2007，23（2）:48-49.
