深圳地区女性泌尿生殖道解脲脲原体基因分型与耐药初探
作者：池晓霞 邓超干 易庭华
【摘要】 目的：了解深圳地区女性泌尿生殖道解脲脲原体（Uu）基因分型情况，初步探讨 Uu 基因型与多重耐药性的关系。方法：采用 PCR 方法对无症状 Uu 携带者（对照组）与 Uu 感染者（病例组）的 Uu 基因进行分群和分型，对随机 抽取的阳性产物进行双向 DNA 测序，最后采用 SPSS 11.5 统计软件包进行统计学分析。结果：①病例组 394 例标本检出 Uu 阳性 214 例，占总受检例数的 54.3%（214/394），其中单纯 Uu 阳性标本 171 例，占总阳性例数的 79.9%（171/214）； 对 171 例单纯 Uu 阳性标本分群共发现：Uu 生物二群 40 例（23.4%，40/171）；混合感染 10 例（5.8%，10/171）；生物一 群 121 例（70.8%，121/171），其中 1 型 32 例（26.4%，32/121）、3 型 22 例（18.2%，22/121）、6 型 28 例（23.1%，28/121）、14 型 11 例（9.1%，11/121）、其它型 28 例（23.1%，28/121）。对照组 213 例标本共检出 Uu 阳性 99 例，占总受检例数 的 46.5%（99/213），单纯 Uu 阳性标本 61 例，占总阳性例数的 61.6%（61/99）。61 例单纯 Uu 阳性标本共分离出：Uu 生物二群 11 例（18.0%，11/61）；混合感染 4 例（8.6%，4/61）；Uu 生物一群 46 例（75.4%，46/61），其中 1 型 24 例 （52.2%，24/46）、3 型 10 例（21.7%，10/46）、6 型 9 例（19.6%，9/46）、14 型 2 例（4.3%，2/46）、其它型 1 例（2.2%，1/46）。②对照组以 Uu 生物一群 1、3、6 基因型单型别感染为主，其中生物一群 1 型感染率明显高于病例组（P < 0.05）；病例组则以 Uu 生物二群与生物一群中各基因型的合并感染为主；③病例组的各类抗生素耐药率明显高于对照组（P < 0.01）。结论：①深圳地区女性泌尿生殖道 Uu 感染以生物一群单型别感染为主，混合感染的比例较低。②对抗生素的滥用导致 Uu 的耐药情况严重，抗生素合理应用问题亟待进一步规范解决。
【关键词】 解脲脲原体；基因分型；泌尿生殖道感染；女性
A Study on Genotyping and Drug Resistant of Ureaplasma Urealyticum in Female Genitourinary Tract in Shenzhen
〔Abstract〕 Objective To investigate the distribution of genotypes of Ureaplasma urealyticum(Uu) in female genitourinary tract and clarify the relationship between the genotypes and multiple drug resistance in patients with Uu in Shenzhen city. Methods The Uu patients were indevided into two groups: the patient group with symptoms and the control group without symptoms. Gene amplification, model typing and two-way sequencing process for DNA of the positive PCR products were carried out; Statistical analysis was done by adopting the statistical software SPSS 11.5. Results ①In 394 samples of patient group, 214 samples showed positive results of Uu DNA with a total positive rate of 54.3% (214/394) in the patient group. A single infection of Uu was detected in 171 cases of 214 positive samples including 40 cases for biologic groupⅡ, 10 cases for mixed infection groups, 121 cases for biologic groupⅠ(32 cases for type 1, 22 cases for type 3, 28 cases for type 6, 11 cases for type 14, 28 cases for other types). In 213 cases of control group, 99 samples showed positive results of Uu DNA with a total positive rate of 46.5% (99/213). A single infection of Uu was detected in 61 cases of 99 positive samples including 11 cases for biologic groupⅡ, 4 cases for mixed infection groups, 46 cases for biologic groupⅠ(24 cases for type 1, 10 cases for type 3, 9 cases for type 6, 2 cases for type 14, 1 case for other type). ②The type 1, type 3 and type 6 in biologic groupⅠof Uu were the main pathogens of Uu in the control group while the mixed infection of genotypes of Uu accounted for the prevalent status of Uu in the patient group. The infection rate of the single Uu genotype in the control group was apparently higher than that in the patient group (P < 0.05). ③The drug resistance rate in patient group was significantly higher than that in the control group (P < 0.01). Conclusion ①In fection with Uu in Shenzhen was commonly seen belonging chiefly to the single type infection, while rate of mixed infection was relatively lower. ②Abused application of antibiotics led to serious drug endurance of Uu. Therefore, the problem related to reasonable application of antibiotics needed to be schematized and solved to a further step.
〔Key Words〕 Ureaplasma urealyticum; Genotype; Genitourinary Tract Infection; Female
解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum, Uu）是人类泌尿生殖道常见的一种共生微生物，1998 年将脲原体生物型 1 和 2 分别定义为微小支原体（U.parvum）和解脲脲原体（U.urealyticum）。大量报道了Uu 与许多疾病有关，但 Uu 与这些疾病的联系还缺乏有力的病因学证据。关于 Uu 的致病机制知之甚少，感染的危险因素更不清楚。为了了解深圳地区女性泌尿生殖道解脲脲原体（Uu）基因分型情况，进一步明确基因型与多重耐药性间的关系，我们做了初步研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 病例选取 收集我院（深圳市第二人民）2006 年 1 月至 2006 年 4 月在皮肤性病门诊及妇科就诊的病人标本 394 份，均为因有症状或（和）体征而就诊的患者。年龄 2~69 岁，平均（31.2±4.3）岁。全部病例经询问病史，用液体培养的方法对 Uu 进行筛查试验，阳性标本转固体培养基复查，并留取标本待后作 PCR 测定。
1.1.2 对照组 收集同期正常体检人群标本 213 份，均无自觉症状，平均年龄（28.3±4.1）岁。实验室检查同前。
1.1.3 标准菌株 由深圳匹基生物工程有限公司提供。
1.2 主要试剂
Uu 选择性液体培养基（含培养鉴定和药敏试验）：法国梅里埃公司提供；Uu 固体培养基：上海生工生物工程技术服务有限公司提供；DNA 定量测定试剂盒：深圳匹基生物工程有限公司提供；Taq DNA 聚合酶：MBI 公司；引物：参照文献设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；解脲脲原体基因型引物设计：按照 Teng 等[1]设计合成的寡核苷酸引物为生物群特异性引物 UMS-125 与 UMA-226（简称 U1），按照 Kong F 等[2，3]设计合成的寡核苷酸引物为分型引物 UMS-125 与 UMA -269（简称 U2)，及 UMS-125 与 UMA-296（简称 U3）。以上引物均用于扩增解脲脲原体 MBA 基因 5’末端，生物一群用 U1 扩增 PCR 产物片断为 403 bp 或 404 bp，生物二群用 U1 扩增 PCR 产物为 448 bp；生物一群中 3/14 型用 U2 扩增，1/6 型用 U3 扩增， PCR 产物均为 442 bp。以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：①群特异性引物 U1： UMS-125： 5’- GTA TTT G CAATC TTT ATA TGT TTT CG - 3’；UMA -226：5’- CAG CTG ATG TAA GTG CAG CAT TAA ATTC - 3’。②分型引物 U2：UMS-125： 5’- GTA TTT GCA ATC TTT ATA TGT TTT CG - 3’；UMA - 269：5’- CTA AAT GAC CTT TTT CAA GTG TAC - 3’。③分型引物 U3：UMS-125：5’- GTA TTT GCA ATC TTT ATA TGT TTT CG - 3’；UMA-296'：5’-CCA AAT GAC CTT TTG TAA CTA GAT - 3’。
1.3 实验方法
将收集的标本接种至液体培养基，初筛解脲脲原体阳性的标本保留；提取 DNA 模板；荧光定量 PCR；解脲脲原体的分群与生物一群的分型检测；PCR 产物的纯化；PCR 产物的双向 DNA 测序。
1.4 统计学处理
所有试验资料均采用 SPSS 11.5 统计软件包进行统计学分析；P < 0.05 作为显著性界限。
2 结 果
2.1 解脲脲原体液体培养及荧光定量 PCR 结果
2.1.1 液体选择培养分离鉴定结果 病例组检出阳性 216 例，对照组检出阳性 99 例。
2.1.2 荧光定量 PCR 检测结果 病例组共检出阳性 214 例，有 2 例未检出，阳性率为 54.3%；对照组检出阳性 99 例，与液体培养分离结果一致 ，阳性率为 46.6%。具体结果见表 1。
2.2 解脲脲原体分群情况
将荧光定量 PCR 检测病例组中的 2 例未检出 Uu 标本转种在固体培养基，5 d 后不生长，该资料弃掉。从病例组 214 例中检出 171（79.9%）例 Uu 单纯感染标本。其中检出生物一群 121 例，生物二群 40 例，两群混合感染 10 例 ；从对照组 99 例共检出 61（61.6%）例 Uu 单纯感染标本，其中生物一群 46 例，生物二群 11 例，两群混合感染 4 例。两组人群均以生物一群感染为主。结果见表 2。临床标本经扩增的分群结果见图 1。
2.3 解脲脲原体分型结果
2.3.1 对全部单纯 Uu 感染标本进行基因分型，以生物一群 1、3、6、14 型中两个或两个以上同时检出或生物一群和生物二群同时检出为多型别感染，而以生物一群 1、3、6、14 型单独检出为单型别感染。
2.3.2 两组人群生物一群的单型别分型情况 对生物一群进行基因分型，检出结果：病例组 121 例标本检出生物一群 1 型 32 例（26.4%）、3 型 22 例（18.2%）、6 型 28 例（23.1%）、14 型 11 例（9.1%）、其它型 28 例（23.1%），合计 1、3、6、14 型单型别感染 93 例（76.9%）。 对照组 46 例标本检出生物一群 1 型 24 例（52.2%）、3 型 10 例（21.7%）、6 型 9 例（19.6%）、14 型 2 例（4.3%）、其它型 1 例（2.2%），合计 1、3、6、14 型单型别感染 45 例（97.8%）。经统计学分析得知：病例组与对照组生物一群1型的感染率的差别有显著性意义（P < 0.05），其余各组间无差别（P > 0.05）。
2.3.3 病例组 Uu 基因型 生物二群与生物一群中各基因型的合并感染；对照组 Uu 基因型：生物一群的 1、3、6 单型别感染。
2.4 解脲脲原体的耐药情况
病例组 214 例标本药敏试验结果统计：红霉素的耐药率 52.1%，阿奇霉素的耐药率 40.0%，四环素的耐药率 25.0%，氧氟沙星的耐药率 30.3%，环丙沙星的耐药率 11.9%，交沙霉素和强力霉素的耐药率较低，分别为 11.0% 和 10.0%。另外，原始霉素和克拉霉素几乎 100% 敏感。结果见图 2。而对照组的药敏试验结果：各类抗生素的耐药率为 0，两组比较差异非常显著（P < 0.01）。
3 讨 论
Uu 是女性泌尿生殖道中一种常见的支原体，当泌尿生殖道发生炎症，黏膜表面受损时其从破损口侵入，引起感染。有研究认为：Uu 在机体免疫力低下或黏膜受损的情况下大量繁殖而致病，其致病机理可能是：Uu 自细胞表面嵌入，与宿主细胞争夺营养物质，致使宿主细胞染色体异常，影响蛋白质和 DNA 合成，严重者可导致细胞的死亡。具有致病性的支原体通过其特殊结构，紧紧黏附于易感宿主细胞膜表面的受体上，这种黏附细胞的特性是感染的先决条件。现已经证实是女性下生殖道的主要定植者，亦是黏液脓性宫颈炎（MPC）的可能病原体， 尽管关于 Uu 与疾病的关系报道很多，但至今仍无统一的说法[4]。
有关报道显示 Uu 在我国各地报道的阳性分离率差别很大[5]，本研究采用液体分离培养法作为泌尿生殖道支原体过筛试验，总检出率为 51.6%，另用荧光定量核酸扩增（FQ-PCR）作复检确认试验，其中有 2 份标本未检出 Uu ，这可能与液体培养分离方法是以颜色的改变来判断生长与否有关。虽然其中也加入了抗生素，但并不能抑制支原体外的所有细菌生长，且该 2 份标本均为女性拭子，女性生殖道菌群复杂，容易污染[6]。据报道，使用商业化的泌尿生殖道支原体培养、鉴定和药敏试剂盒，由于没有进行固体培养或过滤转种鉴定，以此判断支原体感染，将有 20% 的假阳性。因此，在临床标本中若筛查检出 Uu 阳性，建议进行固体培养或过滤转种，确保检测的准确性。
本研究由于临床检查到 Uu 并不能确定是携带状态还是感染状态，这给诊断与带来困难，是临床中亟待解决的问题。本研究试图通过对门诊就诊人群的调查，研究 Uu 检出率、生物分群以及生物一群的基因分型情况，为进一步研究 Uu 的致病性奠定基础。本研究资料显示病例组的 Uu 阳性率为 54.3%，对照组的 Uu 阳性率是 46.6%，病例组的 Uu 阳性检出率比对照组的稍高，但差别没有统计学意义，说明本地区不论患者还是健康人群其 Uu 的阳性检出率都较高，同时再次证实 Uu 可能是女性泌尿生殖道常见的共生微生物，但是否在一定条件下致病有待进一步研究。另外，两组人群均以生物一群感染为主，以单型别感染为主。这与覃春容等[7]报道的结果一致。
临床上关于 Uu 致病的报道不多。近年来被认为是导致如习惯性流产、早产、胎膜早破、低体重用儿、新生儿围产期死亡等的重要因素[8]。由 Uu 感染的病人临床症状差异很大，有部分病人有明显的尿道刺激征，有些病人久治不愈，但部分病人却只是无任何症状和体征的“携带者”。 关于 Uu 治疗的问题，由于至今为止，CLSI 仍没有公开有关药物敏试验的标准程序文件，国内外相关的方法大体有 IST、微量肉汤以及琼脂稀释法等。据罗迪青[8]等报道 2001 年 - 2004 年我国 Uu 耐药率居前三位的是：红霉素、氧氟沙星及四环素。本研究发现深圳地区耐 Uu 的药物排名是：红霉素、阿奇霉素、四环素、氧氟沙星，与全国的报道相似，这与本院的医生的用药方式和药房的储备药物有关，如一些本院药房没有的药物：原始霉素和克拉霉素，几乎是 100% 敏感。因此，合理使用抗生素是避免 Uu 耐药的关键。另外，本研究发现：生物二群与生物一群中各基因型的合并感染的病例耐药较严重，存在多重耐药，这是否是本地区的耐药基因特点有待进一步的论证。如果有标准的药敏试验方法，那么各地耐药情况的可比性就增加了[9]。
【】
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