脑伤宁对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

【摘要】  目的 观察脑伤宁对大鼠脑缺血再灌注脑损伤的保护作用。方法 凝闭大鼠双侧椎动脉4～5 h后，夹闭颈总动脉30 min，再灌注90 min，造成大鼠脑缺血再灌注损伤模型，观察脑伤宁对脑组织中生化指标及脑电图的影响。结果 缺血再灌注造成脑组织严重损伤，脑组织中水、Na+、Ca2+含量及丙二醛(MDA)含量较对照组明显增高，而超氧化物歧化酶(SOD)活力较对照组降低，并伴有脑电图异常和脑组织结构病理性改变。夹闭颈总动脉前30 min 腹腔注射脑伤宁能降低脑组织中水、Na+、Ca2+含量及MDA含量，并提高SOD活力，对组织学检查及脑电图也有所改善。结论 脑伤宁对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

【关键词】  脑伤宁；脑缺血；再灌注损伤；Ca2+超载

　　Abstract : Objective To study the protective effects of Naoshangning recipe on brain injury in rats.Methods  The bilateral vertebral arteries of rats were occluded, and 4～5 h later, the carotid arteries of rats in the conscious condition were occluded for 30 min followed by reperfusion for 90 min.The effects of Naoshangning recipe on the contents of water, Na+, and Ca2+ in cortex, malondialdehyde (MDA) content and superoxide dismutase (SOD) activity in brain hemispheres, as well as the EEG activities were observed.Results  30 min ischemia and 90 min after reperfusion, the contents of water, Na+, Ca2+, and MDA were increased, and the SOD activity was reduced with abnormal EEG activity and ischemic injury in the brain tissues.Naoshangning recipe decreased the elevated water, Na+, Ca2+, and MDA contents, increased the SOD activity, reduced the ischemic injury of brain tissue, and promoted the recovery of EEG activities.Conclusion Naoshangning has protective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.

　　Key words:   Naoshangning recipe; cerebral ischemia; reperfusion injury; Ca2+ overloading

　　脑伤宁是武汉大学人民神经科王安国教授之经验方，由川芎、当归、白芍、琥珀、钩藤、远志、茯苓、夜交藤等中药组成，具有活血化瘀、宁心安神、平肝熄风、健脾除湿之功效。早期药研究［1］表明脑伤宁可使高血黏模型大鼠的全血黏度、血浆黏度及红细胞压积明显降低，为其临床应用提供初步理论依据，本实验进一步研究脑伤宁对急性脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用，并探讨其作用机制。

　　1  材料和仪器

　　1.1  药材
    
　　实验所需中药材均购自湖北省中药材公司,由武汉大学人民医院药学部质检科鉴定。

　　1.2  药物与试剂
    
　　丁咯地尔注射液，批号01754，法国施维雅药厂生产。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，批号20031004；丙二醛(MDA)试剂盒，批号20030811，均购自南京建成生物制剂研究所。

　　1.3  动物
    
　　Wistar大鼠，雄性，体质量300～350 g，10～12月龄，由武汉大学医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鄂）2003-0004。

　　1.4  仪器
    
　　AA-670原子分光光度计（日本岛津公司），RM-6200型多道生理记录仪（日本岛津公司）。

　　2  实验方法

　　2.1  脑伤宁汤剂的制备
    
　　参照［1］的方法制备。

　　2.2  模型的建立与给药
    
　　大鼠50只，随机分为5组，每组10只：即假手术（sham）组及单纯缺血再灌注(IR)组，脑伤宁2个剂量组及丁咯地尔组。四血管结扎全脑缺血模型的制备文献［2］。大鼠腹腔注射水合氯醛400 mg·kg-1后，固定于立体定位仪，电烧灼凝闭两侧椎动脉，然后分离双侧颈总动脉并置套扣待用。置电极于大鼠额顶，描记脑电图(EEG)。手术后4～5 h，待大鼠完全清醒后，试验动物分别腹腔注射 25、100 mg·kg-1脑伤宁，或5 mg·kg-1丁咯地尔注射液，30 min后扣闭两侧颈总动脉达30 min，松扣后再灌注90 min。sham组同样手术，但不阻断动脉。

　　2.3  检测指标
    
　　再灌注结束时迅速断头取出脑组织，去脑干和小脑，将脑组织划“+”分为4个部分，3份立即低温(-20 ℃)保存用于MDA含量、SOD活性和病理组织学检查，1份用于测定脑组织水、Na+、Ca2+含量。其中脑水分用干湿重法，Na+、Ca2+含量用火焰原子吸收分光光度法［3］,邻苯三酚改良法［4］测定SOD活性，硫代巴比妥酸法［5］测定MDA含量。

　　2.4  统计学处理
    
　　实验数据以±s表示，对EEG的影响采用Ridit分析，其它采用组间t检验进行统计学分析，P<0.05为差异有显著性。

　　3  结果

　　3.1  对脑缺血再灌注动物死亡率及EEG的影响
    
　　在整个缺血及再灌注期间，IR组、脑伤宁25 mg·kg-1组及丁咯地尔组分别有3、1、1只动物因缺血损伤引起动物死亡。四血管结扎后大鼠EEG电压波幅变小，脑电很快抑制变平，按EEG变化程度分为5级［6］，即达到缺血前波幅100%属1级，75%以上为2级，75%～25%为3级，25%以下为4级，几乎呈等电位的为5级。sham组在整个缺血及再灌注期间，EEG变化均以Ⅰ级为主。而缺血再灌注组缺血期EEG变化Ⅳ级有3只，Ⅴ级有3只；再灌注期EEG变化Ⅳ级有2只，Ⅴ级有4只，经Ridit分析，与sham组比较差异显著，P<0.05。脑伤宁组EEG改变以Ⅲ级及Ⅳ级为主，经Ridit分析，与IR组比较差异显著，P<0.05或P<0.01，说明脑伤宁可显著改善EEG的恢复程度(见表1)。

　　表1  对大鼠脑缺血再灌注后EEG幅度变化的影响（略）

　　Tab.1  Effect on EEG in rats inducedby cerebral ischemia reperfusion

　　与假手术组比较：*P <0.05；与缺血再灌注组比较：#P <0.05，##P <0.01

　　3.2  对脑组织水、Na+、Ca2+、MDA含量及SOD活性的影响
    
　　再灌注后IR组脑组织水、Na+、Ca2+以及MDA含量均明显高于sham组(P<0.05或P<0.01)。脑伤宁组脑组织水、Na+、Ca2+，以及MDA含量明显低于IR组(P<0.05或P<0.01)。而IR组脑组织SOD活性低于sham组(P<0.01)，脑伤宁组脑组织SOD活性明显高于IR组(P<0.01)，与sham组接近(见表2)。

　　3.3  对脑组织形态学改变的影响
    
　　缺血再灌注造成神经元锥体细胞肿胀、变形，乃至核固缩，核溶解，细胞坏死，间质也变得疏松。脑伤宁能显著减轻这种损伤性改变，使坏死细胞数目减少，可见到较为完整的锥体细胞，间质也比较致密。

　　4  讨论
    
　　脑缺血再灌注损伤的发生机理涉及诸多方面，Ca2+超载与氧自由基的大量产生在其中扮演着重要的角色。本实验观察到脑缺血再灌注损伤后大脑皮层Ca2+累积，MDA含量增加，与［3］报道的结果一致，脑伤宁能明显降低缺血再灌注后脑组织的Ca2+和MDA含量，增强SOD活性，显示出抗Ca2+超载及抗氧自由基作用。
    
　　表2  对大鼠脑缺血再灌注后生化指标变化的影响（略）

　　Tab.2  Effect on biochemical index induced by cerebral ischemia reperfusion in rat

　　与假手术组比较：*P <0.05，**P <0.01；与缺血再灌注组比较：#P <0.05，##P <0.01

　　脑水肿是脑缺血的主要并发症之一，同时又是加重脑缺血的原因。由于缺血缺氧致使脑组织能量耗竭，细胞膜Na+?K+泵功能障碍，Ca2+?ATP酶活性降低，导致离子稳态失衡，产生脑水肿。脑伤宁能剂量依赖性地减少缺血再灌注引起的钠、水潴留，减轻脑水肿，提示脑伤宁可能阻止脑缺血造成的细胞膜离子转运紊乱，从而防止细胞内的Ca2+超载与细胞损伤。EEG的变化及形态学检查也明确显示了脑伤宁对脑缺血再灌注损伤的保护作用，从而在电生理及形态学方面证实了脑伤宁的脑保护作用。
    
　　综上所述，脑伤宁通过降低脑内Ca2+含量，减轻脑水肿，减少脂质过氧化反应，改善脑电图，缓解锥体细胞的损伤坏死情况，从多个方面显示了其对脑缺血再灌注损伤的保护作用，其机制与抗Ca2+超载和抗脂质过氧化作用有关，此结果为其临床应用提供了实验依据。

【文献】
  　　［1］ 王芳，周珂，余恩欣.脑伤宁脑外伤后综合征的药效学研究［J］.广东药学院学报，2003，19(3)：249-252.

　　［2］ 彭新琦，可君.三重莨菪类药物在大鼠急性前脑缺血及再灌注损伤中的作用［J］.药报，1992，13(4)：357-361.

　　［3］ 赵卫国，张天锡，施爱芳，等.脑缺血脑水肿的实验研究-钙在脑缺血损伤中的作用［J］.中华神经精神科杂志，1991，24(1)：27-30.

　　［4］ 静天玉，赵晓瑜.用终止剂改进超氧化物歧化酶邻苯三酚测定法［J］.生物化学与生物物理学进展，1995，22(1)：84-88.

　　［5］ 向荣.过氧化脂质硫代巴比妥酸分光光度法的改进［J］.生物化学与生物物理学进展，1990，17(3)：241-246.

　　［6］ 李盈盈，王子灿，李麟仙.家兔急性不完全脑缺血模型和特点实验研究［J］.中华神经精神科杂志，1987，20(2)：301-304.