神奇灵颗粒剂中总蛋白含量测定的方法学研究
作者：王全喜， 王一飞， 杨珂， 黄园
【摘要】 目的对神奇灵颗粒剂中的总蛋白含量进行测定，建立一种测定食品、药品测定蛋白含量的方法学。方法对样品过滤后，采用双缩脲法、Folin?酚试剂法，以牛血清白蛋白做为对照品，测定吸光度，并做精密度、样品重现性、加样回收实验。结果 双缩脲法快速、简便，得到样品的含量为47.21%，精密度实验RSD=0.20%(n=6)，样品重现性好，RSD=0.99%(n=6)，平均回收率为96.67%，RSD=0.45%(n=6)；两种方法测定之间有差异。结论所采用方法可作为蛋白含量比较高的食品、药品制剂中蛋白含量的测定。
【关键词】 神奇灵颗粒剂； 蛋白； 双缩脲法； Folin?酚试剂法
Abstract：ObjectiveTo determine total protein in Shenqiling granules,and establish the methodology to assay protein level in foods and drugs. MethodsAfter filtering the samples, take bovine serum albumin as control article,use biuret method, Folin－lowry to determine the absorbance, and then do the tests for precision, reproducibility, average recovery.ResultsThe biuret method is fast and convenient. The average content of the samples was 47.21% in the precision experiment,RSD=0.20% (n=6). The absorbance reproducibility of the samples was good, RSD=0.99%(n=6),the average recovery was 96.67%,RSD=0.45%(n=6). There had a difference between biuret menthod and Folin?lowry.ConclusionThe method in this paper can be used for determining protein which are rich in drugs and food.
Key words：Protein level assaying； Biuret； Methodolgy； Folin?lowry
神奇灵颗粒是由几种中药的水提取物，辅以乳清蛋白、蜂蜜等按一定比例加工成型的一种保健食品，具有改善免疫功能、调节人体的适应状态功能，适用于免疫低下，运动状态下降以及体力虚弱的人群，其中蛋白质是主要的功效成分。《药典》以及食品标准中传统的方法是用凯氏定氮法，虽然测定准确，但操作繁琐费时，需经过冗长的消化、蒸馏等处理过程，而且容易产生有毒的气体，不适宜快速、简便地测定一般食品药品中的蛋白含量。
双缩脲法测定蛋白的原理是根据蛋白质肽键在碱性溶液中能与Cu2+形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白含量成正比，利用标准蛋白质溶液作对照，采用紫外?可见分光光度法测定供试品蛋白质含量，Folin?酚试剂法是在碱性溶液中与Cu2+形成复合物，在加入酚试剂后产生蓝色化合物，该蓝色化合物在一定吸光度下与蛋白的含量成正比［1］。本文采用双缩脲法，Folin?酚试剂法测定神奇灵颗粒剂中蛋白的含量，从而为食品、药品行业建立一种快速、准确测定蛋白含量的方法。
1 器材
1.1 仪器美国BECKMAN公司的DU640 Nuclear Acid and Protein Analyzer；天平；漩涡混合器。
1.2 试剂
牛血清白蛋白对照品（BSA,生化试剂，上海伯奥生物科技有限公司，批号050912）；福林酚?乙试剂（生化试剂，北京鼎国）；神奇灵颗粒剂（广东省研究所自制提供，批号20050929）；其余试剂均为国产分析纯，文中所提水均为纯水。
2 方法与结果
2.1 双缩脲法
2.1.1 双缩脲试剂的制备
硫酸铜1.5 g，酒石酸钾钠6 g，溶于500 ml水，搅拌下加入含30 g氢氧化钠的溶液，定容至1000 ml，加入碘1 g备用。
2.1.2 标准品试液的制备
精密称量0.4009 gBSA，准确加入20 ml纯水超声溶解15 min，作为标准品试液。
2.1.3 标准曲线的绘制
精密量取标准品试液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 ml分置于试管中，用水补足1 ml，加入双缩脲试剂各4 ml，漩涡混合器混匀，常温下显色30 min后，依紫外分光光度法540 nm下检测吸光度值，以空白调零。最后以各管中蛋白含量(mg/ml)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表1。表1 标准曲线的绘制（略）
回归方程：y＝0.0466x＋0.004 3，r=0.999 6，符合《药典》2005版Ⅰ部对吸光度的要求，且相关性良好。
2.1.4 精密度实验
取样标准品试液6份，每份0.3 ml，加水补足1 ml，以标准曲线制备过程测定吸光度值，均值及RSD。表2 精密度实验（略）
2.1.5 供试品试液的制备与测定
取一定量的本品，研细，精密称量0.4012 g，加水超声15 min溶解，过滤，定容至25 ml，取1 ml，照标准曲线项下的方法，自“加入双缩脲试剂各4 ml………”起，依法测定吸光度，按标准曲线计算蛋白质的含量。
2.1.6 重现性实验
分别精密称量6份本品，依供试品的测定方法，计算蛋白质的含量，计算均值及RSD。表3 重现性实验（略）
样品平均含量为47.21%，RSD=0.99%，n＝6。说明该法测定该样品误差范围小，方法切实可行。
2.1.7 加样回收实验
分别精密称量6份已知含量的本品，加入一定量的标准品试液，同供试品的方法定溶于25 ml水制备，测定吸光度值，计算平均回收率，RSD。表4 加样回收实验（略）
平均回收率为96.67%，RSD＝0.45%，n＝6。说明双缩脲法以及样品处理的过程中损失比较小。
2.2 Folin-酚试剂法
2.2.1 试剂的制备取2 g碳酸钠，0.8 g氢氧化钠溶解于100 ml水中；取1g硫酸铜溶解于100 ml水中；取2 g酒石酸钾钠溶解于100 ml水中。
2.2.2 方法与结果
临用前取①100 ml，②1 ml，③1 ml混匀作为甲试剂，测定时加入甲试剂5 ml混匀静置10 min后加入0.5 ml乙试剂混匀静置30 min，500 nm下测定吸光度值。标准品为0.5 mg/ml的BSA。结果见表5。表5 Folin-酚试剂法标准曲线的制备（略）
3 讨论
3.1 双缩脲试剂配制过程中，加入氢氧化钠时应适当搅拌，防止产生氢氧化铜的沉淀，影响显色效果，而且应做到使用前配制，不易长期存放。
3.2 从表2～3中可以看出，双缩脲法能准确地测定标准蛋白含量，而且变异系数比较小，稳定可靠，重现性好，得到神奇灵颗粒剂中的总蛋白含量为47.21％，这与理论上的值偏小，一方面可能是因为所加乳清蛋白纯度不够，另一方面可能是因为颗粒剂中所含糖分物质过多，影响测定值偏小引起［2］。
3.3 样品不经过滤，测定吸光度明显高于过滤后的，可能是颗粒剂中辅料容易使溶液着色加深，另经4000 r/min离心10 min后测定值又偏低，可能是由于颗粒剂中含有一些不溶于水的蛋白在离心过程中被弃掉所致。
3.4 Folin-酚试剂法测得样品的含量明显低于双缩脲法的结果，可能是因为Folin-酚试剂不能测到不溶于水的蛋白，而且所测蛋白的特异性比较强所致。
综上所述，双缩脲法是一种简便、准确的测定蛋白的方法，Folin-酚试剂法灵敏度高，可是又受多种条件的限制，不适合神奇灵颗粒剂总蛋白的测定。本文所用方法可用来测定食品、药品中所含的蛋白，也可作一般测定含量的方法。
【】
［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅲ部［S］.北京：化学出版社，2005，附录：30.
［2］大连轻工业学院，华南理工大学.食品分析［M］.北京：中国轻工业出版社，1994：226.
